雞白痢沙門菌感染細(xì)胞形成SCV的規(guī)律研究.pdf

1、雞白痢沙門菌(Salmonella enterica serovar Pulloum，Salmonella Pullorum)具有高度宿主專一性，引起的雞白痢具有高發(fā)病率和高死亡率的特點，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。沙門菌具有獨特的感染細(xì)胞機(jī)制，從而保證其在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存。不同于志賀菌、李斯特菌逃避細(xì)胞內(nèi)生物膜并在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制的機(jī)制，沙門菌在宿主細(xì)胞內(nèi)形成一種稱為沙門菌囊泡(Salmonella-containing vacuole

2、，SCV)的結(jié)構(gòu)，沙門菌可在SCV中生存與增殖。目前，關(guān)于沙門菌SCV的研究主要以鼠傷寒沙門菌為模型，雞白痢沙門菌SCV的相關(guān)研究較為匱乏。
　　本研究主要對雞白痢沙門菌感染細(xì)胞后形成SCV的規(guī)律進(jìn)行研究。通過篩選研究雞白痢沙門菌SCV的合適細(xì)胞模型與菌株，探索雞白痢沙門菌在胞內(nèi)形成SCV的規(guī)律，幫助更好地理解雞白痢沙門菌與宿主細(xì)胞間的互作關(guān)系。同時，本研究建立了鑒定雞白痢沙門菌T3SS效應(yīng)蛋白功能的研究方法，為深入地研究雞白痢沙

3、門菌的致病機(jī)理提供了方案。
　　1.雞白痢沙門菌感染細(xì)胞模型的建立
　　用雞白痢沙門菌S06004分別感染HD-11、DF-1、DT-40和LMH四種禽類細(xì)胞系，測定其黏附率和侵襲率，結(jié)果表明，S06004對HD-11的黏附率與侵襲率最高，LMH次之，DF-1最低。S06004對DT-40的黏附率雖很高，但侵襲率比較低。因此，選擇HD-11和LMH作為雞白痢沙門菌感染的細(xì)胞模型更為適合。
　　對1960s-2010s期

4、間分離的50株雞白痢沙門菌感染HD-11和LMH細(xì)胞的黏附率進(jìn)行測定。結(jié)果表明，在HD-11細(xì)胞上，大部分菌株的黏附率與S06004相當(dāng)，但7101、B8605、S9804和S9876的黏附率偏高，其中S9876的黏附率約是S06004的6倍;在LMH細(xì)胞上，大部分菌株的黏附率與S06004相當(dāng)，但S08026、S9876和1306的黏附率偏高，并且S9876的黏附率約是S06004的4倍。在50株雞白痢沙門菌中，S9876是唯一一株在

5、LMH和HD-11上的黏附率均很高的菌株，因此，可作為研究雞白痢沙門菌SCV形成規(guī)律的候選菌株。
　　為了探索細(xì)菌對黏附率之間的關(guān)系，我們從50株雞白痢沙門菌中挑選出黏附率差異明顯的10株代表菌株，利用雞胚模型進(jìn)一步比較細(xì)菌的致病力。以103 CFU/100μL的劑量尿囊腔接種16日齡的海蘭白雞胚。結(jié)果表明，尿囊腔接種C79-13、6803和6201菌株的雞胚死亡數(shù)量最多，而S9876對雞胚的毒力明顯低于這三株。結(jié)合這三株細(xì)菌在H

6、D-11和LMH上的黏附率，C79-13也可作為研究雞白痢沙門菌SCV形成規(guī)律的候選菌株。
　　我們進(jìn)一步比較了C79-13與S9876對HD-11和LMH細(xì)胞的侵襲率，結(jié)果表明C79-13在兩個細(xì)胞系上的侵襲率均高于S9876，因此，我們選擇C79-13作為研究雞白痢沙門菌SCV形成規(guī)律的模式菌株。
　　2.雞白痢沙門菌SCV的形成規(guī)律探索
　　我們成功構(gòu)建了表達(dá)GFP的雞白痢沙門菌C79-13(pYA3334-GF

7、P)，選擇EEA1作為早期SCV的標(biāo)記蛋白，Rab7與Lamp1作為中期SCV的標(biāo)記蛋白，以及CathepsinD作為晚期SCV的標(biāo)記蛋白，用激光共聚焦顯微鏡觀察雞白痢沙門菌C79-13在雞肝癌上皮細(xì)胞系LMH細(xì)胞和禽巨噬細(xì)胞系HD-11細(xì)胞中各階段SCV的形成時間。
　　結(jié)果顯示，在LMH細(xì)胞上，在5 min時約80％的細(xì)菌開始招募EEA1蛋白，形成早期SCV;在15 min時，細(xì)菌開始招募Rab7和Lamp1蛋白，形成中期SC

8、V，且30 min時細(xì)菌招募Rab7的比例最高，而15 min時細(xì)菌招募Lamp1的比例最高;30-45 min時，部分細(xì)菌會招募成熟SCV的標(biāo)記蛋白Cathepsin D，但在60 min時，蛋白招募現(xiàn)象尤為明顯。在禽巨噬細(xì)胞系HD-11上，5-30 min時，可以觀察到早期蛋白EEA1緊緊包圍著細(xì)菌，且比例逐漸升高;15-45 min時，可以觀察到中期蛋白Rab7將細(xì)菌包裹，且比例逐漸升高;中期蛋白Lamp1與晚期蛋白Catheps

9、in D沒有將細(xì)菌包裹的現(xiàn)象，僅在30-60min時，有些細(xì)菌招募Cathepsin D蛋白且比例逐漸下降。
　　為證實激光共聚焦顯微鏡觀察到的HD-11細(xì)胞中的結(jié)果，采用透射電鏡直接觀察細(xì)胞中SCV的形成。30 min時，細(xì)胞中可以很明顯地看到不完整、不封閉的SCV;1 h時，細(xì)菌分開，SCV的膜結(jié)構(gòu)完整封閉，每個SCV只包含一個細(xì)菌;5h時，一些SCV開始出現(xiàn)破損，并可觀察到細(xì)菌的增殖及SCV的分裂。
　　3.雞白痢沙門

10、菌T3SS2效應(yīng)蛋白CigR對SCV的影響
　　CigR是一個膜蛋白，由SPI3編碼的T3SS2效應(yīng)蛋白。有研究表明，cigR基因的缺失會引起沙門菌毒力的增強(qiáng)，但也有研究表明，cigR的缺失會導(dǎo)致其在鼠骨髓巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖能力顯著降低。為解析CigR對雞白痢沙門菌SCV的影響，本研究采用λ-red同源重組系統(tǒng)成功構(gòu)建了雞白痢沙門菌C79-13的cigR基因缺失株C79-13ΔcigR，并初步解析了CigR的功能。結(jié)果顯示，cigR