銅綠假單胞菌T6SS效應(yīng)蛋白Tsel、Tse3及其免疫蛋白Tsil、Tsi3結(jié)構(gòu)與功能的研究.pdf

1、病原菌在侵染宿主時(shí)，一方面要獲取一定的營(yíng)養(yǎng)供給，另一方面也要確保自身在侵染過(guò)程中能夠成功逃逸宿主免疫系統(tǒng)的清除。這些功能的實(shí)現(xiàn)，就主要依賴于細(xì)菌的分泌系統(tǒng)來(lái)完成。分泌系統(tǒng)所涉及的蛋白，包括細(xì)菌合成后儲(chǔ)存于自身細(xì)胞中或細(xì)胞表面，或者是分泌到周?chē)h(huán)境中，再或者是注入宿主細(xì)胞體內(nèi)，這些分泌蛋白參與了細(xì)菌諸多的生物過(guò)程，如，細(xì)菌侵染時(shí)的毒力，鞭毛合成及功能的實(shí)現(xiàn)，對(duì)宿主相關(guān)系統(tǒng)的改造和利用以及對(duì)藥物的抗性等。
　　 目前，在作為動(dòng)植物病

2、原菌的革蘭氏陰性菌中，已發(fā)現(xiàn)7種相關(guān)的分泌系統(tǒng)，依次命名為T(mén)1SS至T7SS。這些分泌系統(tǒng)可大致分為一步或者兩步分泌系統(tǒng)，其中，一步分泌系統(tǒng)包括T1SS，T3SS和T4SS，它們一般直接通過(guò)一個(gè)導(dǎo)管穿過(guò)細(xì)菌的外膜;兩步反應(yīng)的分泌系統(tǒng)，其底物蛋白需要先通過(guò)一般的分泌途徑(Sec translocon)或者是雙-精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑(Tat)，轉(zhuǎn)運(yùn)跨過(guò)內(nèi)膜進(jìn)入周質(zhì)空間，第二步，將N端信號(hào)序列切除，底物蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，二步分泌系統(tǒng)包括T2SS和T

3、5SS。與上述幾種分泌系統(tǒng)相比，關(guān)于T6SS的組裝和生物合成，我們還知之甚少。有研究組，已定位一個(gè)包含15-20個(gè)保守開(kāi)放閱讀框的基因簇，這個(gè)基因簇被認(rèn)定可用來(lái)編碼T6SS結(jié)構(gòu)組件蛋白。一般認(rèn)為，T6SS由13個(gè)作為核心組件的亞基形成一個(gè)微型裝置(minimal apparatus)，這些核心組件還可再與其它蛋白存在相互作用。這些核心組件中，有一些與噬菌體尾部，刺突，鞘或者基板等相似的結(jié)構(gòu)，另一些蛋白可插入到內(nèi)膜或外膜上，從而將這個(gè)噬菌

4、體樣結(jié)構(gòu)錨定在細(xì)胞外膜上?，F(xiàn)在，普遍的模型認(rèn)為，這些核心組件共同形成一個(gè)可錨定在細(xì)菌外膜上的倒轉(zhuǎn)的噬菌體樣結(jié)構(gòu)。同時(shí)，在T6SS膜上相關(guān)蛋白中，鑒定出與T4SS相似的組分，提示我們，T6SS可能是T4SS和噬菌體尾管組成的鑲嵌體。Joseph D.Mougous研究組，在銅綠假單胞菌中鑒定了三個(gè)T6SS底物（或稱效應(yīng)蛋白），依次命名為T(mén)se1-3（type six exported1-3）。Tse2被鑒定為毒素-免疫體系的毒素成分，輸入

5、至缺乏相應(yīng)免疫抑制蛋白的受體細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，以目前尚且未知的機(jī)制，引起宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯，從而保證銅綠假單胞菌在微環(huán)境中的生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。Tse1和Tse3定位于受體細(xì)胞的周質(zhì)空間，可降解受體細(xì)胞細(xì)胞壁。同時(shí)，銅綠假單胞菌就需要進(jìn)化出一套相應(yīng)的可抑制自身Tse作用的免疫蛋白Tsi(typeⅥ secretion immunity protein)，從而成功避免其被自身的Tse所損傷。該研究組用Tse1和Tse3處理提取的Escherichi

6、a coli細(xì)胞壁，并對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行HPLC-MS分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明Tse1具有酰胺酶（DL-內(nèi)肽酶）活性，屬于Tae（typeⅥ amidase effector）超家族，作用位點(diǎn)為肽聚糖γ-D-Glu-L-meso-diaminopimelic acid(γ-D-Glu-m-DAP)間的肽鍵;Tse3具有溶菌酶活性，水解糖主鏈上N-乙酰胞壁酸(MurNAc)和N-乙酰葡萄糖胺(Gl cNAc)間的β-1，4糖苷鍵。
　　 結(jié)

7、構(gòu)生物學(xué)，研究生物大分子的性質(zhì)以及分子之間的相互作用，其優(yōu)勢(shì)在于，在結(jié)構(gòu)決定功能的理論指導(dǎo)下，獲得大分子的三維空間結(jié)構(gòu)，可以幫助我們更好地理解大分子的生物學(xué)功能，以及發(fā)現(xiàn)它未曾被揭示的功能。Tsi2結(jié)構(gòu)的解析，是研究T6SS效應(yīng)蛋白-免疫抑制蛋白結(jié)構(gòu)和功能的第一步，但是Tse2-Tsi2復(fù)合物的結(jié)構(gòu)尚未解析，因此闡明銅綠假單胞菌T6SS效應(yīng)蛋白-免疫抑制蛋白的相互作用機(jī)制，以及詮釋T6SS這個(gè)精密轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)器的運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制，依然有很多相關(guān)工作要

8、繼續(xù)。
　　 本文研究目的和研究?jī)?nèi)容:
　　 在功能研究組的工作基礎(chǔ)上，本課題借助X射線晶體學(xué)手段，我們期望通過(guò)解析Tse1單體，Tse3單體，Tse1-Tsi1復(fù)合物和Tse3-Tsi3復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)，最好還能獲得Tse與底物肽聚糖的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，并結(jié)合相關(guān)生化佐證實(shí)驗(yàn)，更好地從分子層面闡釋Tse1和Tse3對(duì)抗與其競(jìng)爭(zhēng)的革蘭氏陰性菌以及可成功保護(hù)自身的機(jī)制，同時(shí)建立一個(gè)可較全面解析T6SS攻擊宿主細(xì)胞的普遍的模式框架，

9、并為最終控制和預(yù)防銅綠假單胞菌感染，提供新的靶向治療視角。具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　 1)解析Tse1及Tse1-Tsi1復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，分析其相互作用界面，識(shí)別機(jī)制及Tsi1抑制Tse1酰胺酶活性的分子機(jī)理，并分析Tsi1與Tse1高特異性相互作用的機(jī)制。我們解析了Tse1單體和Tse1-(6-148)-Tsi1-(20-end)復(fù)合物結(jié)構(gòu)，分辨率分別為1.4(A)和1.6(A)(1(A)=0.1 nm)。
　　 2)

10、在大腸桿菌細(xì)胞周質(zhì)空間中轉(zhuǎn)入Tse1表達(dá)載體并誘導(dǎo)其表達(dá)，進(jìn)行大腸桿菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定，驗(yàn)證Tse1對(duì)大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）細(xì)胞壁的降解作用。
　　 3)通過(guò)活性中心關(guān)鍵氨基酸殘基突變，分析Tse1催化機(jī)制，驗(yàn)證其酰胺酶活性。
　　 本課題的創(chuàng)新點(diǎn)如下:
　　 1)通過(guò)Tse1三維結(jié)構(gòu)分析，表明Tse1是NlpC/P60超家族成員，有一個(gè)進(jìn)化上保守的催化中心和結(jié)構(gòu)核。Tse1序列上并無(wú)可調(diào)節(jié)自身活性的序列，提示其更

11、具破壞性和殺傷力。
　　 2)不同于已解析三維結(jié)構(gòu)的NlpC/P60家族的其他成員，Tse1空間結(jié)構(gòu)中有四個(gè)反平行β-折疊片，而一般的NlpC/P60則擁有5個(gè)。代替第五個(gè)反平行β-折疊片，是一個(gè)可與Tsi1相互作用的功能性loop，進(jìn)化上使其與Tsi1的抑制功能相適應(yīng)。
　　 3) Tse1單體全結(jié)構(gòu)是個(gè)包括花瓣和花萼的花樣（flower-like）結(jié)構(gòu)，其中兩個(gè)裂溝形成一個(gè)Y型的活性位點(diǎn)凹槽，區(qū)別于NlpC/P60家

12、族經(jīng)典的Ⅴ型活性位點(diǎn)凹槽。催化中心的第三個(gè)氨基酸是半胱氨酸殘基，并且在功能上是非必需的，這也區(qū)別于已解析三維結(jié)構(gòu)的NlpC/P60家族的其他成員。也就是說(shuō)，Tse1反應(yīng)中心是個(gè)催化二聯(lián)體，而不是NlpC/P60家族經(jīng)典的催化三聯(lián)體。
　　 4)在保守的Gly67后插入了一個(gè)helix，表明Tse1雖然在進(jìn)化上屬于NlpC/P60超家族，但是其通過(guò)突變和插入獲得了新的特性。
　　 5) Tsi1在序列上，與半胱氨酸蛋白酶抑

13、制劑家族的木瓜蛋白酶抑制劑幾乎無(wú)同源性。
　　 6) Tsi1采用全β-片折疊，形成一個(gè)半β-螺旋槳樣(β-propeller-like)結(jié)構(gòu)。Tsi1結(jié)構(gòu)中，連接β-片的功能性loop類似于5個(gè)指頭，可與Tse1相互作用，其中位于HI loop的Ser109可直接與Tse1反應(yīng)中心氨基酸殘基相互作用。Tsi1采用的是更特異和更緊密的五指接觸模式來(lái)抑制Tse1，區(qū)別于已發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典的半胱氨酸蛋白酶抑制劑與酰胺酶的三部分（三指）相互

14、作用模式。
　　 7)通過(guò)Tsi1-Tse1與cystatin-peptidase(如stefin A-cathepsin H)結(jié)構(gòu)比對(duì)，表明Tsi1采用更多的分子間H鍵，更多的功能性loop和更大的接觸表面來(lái)抑制Tsel的酰胺酶活性。提示我們，Tsi1-Tse1間這種區(qū)別于一般的半胱氨酸蛋白酶抑制劑-酰胺酶的高特異性和高緊密的相互作用模式的趨同進(jìn)化(converged evolution)，可能是銅綠假單胞菌細(xì)胞代謝循環(huán)中細(xì)胞