銅綠假單胞菌噬菌體PaP3末端酶的克隆表達與功能鑒定.pdf

1、末端酶(terminase)又稱為包裝酶，是dsDNA病毒和噬菌體包裝過程的必要功能蛋白。這類病毒在生物合成的晚期，于宿主胞漿內(nèi)形成大量空的前衣殼(procapsid)，尾蛋白和以滾環(huán)復制方式產(chǎn)生的多基因組串聯(lián)拷貝體(concatemer，concatemericDNA)，這些由單拷貝基因組首尾相連組成的長鏈DNA就為末端酶的作用底物。末端酶從中剪切出單個基因組，并將該基因組填塞入已組裝好的前頭中，完成病毒的包裝。噬菌體末端酶通常具有兩

2、個亞單位，因分子量不同而分為大亞單位(largesubunit)和小亞單位(smallsubunit)。末端酶所參與的病毒包裝過程具有突出特點，可作為蛋白質與蛋白質，蛋白質與核酸等大分子之間復雜相互作用的研究載體；同時，由于末端酶作為病毒生物周期中的特有功能蛋白質，其宿主(如細菌和真核生物)根本不存在這一生理過程和相關的功能酶，將末端酶作為控制噬菌體和病毒感染的藥物靶點，具有高度的特異性和安全性。因此，末端酶的克隆表達、功能鑒定及深入的

3、應用研究是一個極富意義的研究領域。 噬菌體PaP3為本室分離鑒定的一株銅綠假單胞菌噬菌體，在完成其基因組全序列測定(GenBank登錄號：NC_004466)后發(fā)現(xiàn)，所有71個推定基因中，同源序列比對只發(fā)現(xiàn)了6個推定基因在公共數(shù)據(jù)庫中存在同源性序列，其中orf3編碼產(chǎn)物被推定為噬菌體末端酶大亞單位。在基因組測序完成之后，基因功能的研究成為我們面前的重要任務。為了完善噬菌體PaP3基因組注釋并進一步深入認識該噬菌體的包裝機制，本研

4、究通過克隆表達該基因，獲得了具有末端酶大亞單位活性的重組蛋白質，證實了該基因的功能；并在此基礎上，推定PaP3的orf1編碼蛋白為末端酶小亞基，然后通過實驗室證據(jù)初步證實了推論的正確性，完成了對噬菌體PaP3末端酶全酶的功能鑒定。主要的研究內(nèi)容和結果如下： 1.噬菌體PaP3推定末端酶大亞單位的包涵體表達、純化與復性：①利用：PCR從噬菌體PaP3基因組上擴增出推定末端酶大亞單位(terminaselargesubunit)編碼

5、基因tls。②將推定tls全長基因插入表達載體pQE31，轉化大腸桿菌JM109，獲得的pQE31-tls/JM109工程菌表達產(chǎn)物經(jīng)超聲裂解后，90％以上的融合蛋白質H6-TLS以包涵體的形式存在。③將pQE31-tls/JM109工程菌裝料入在3.75L發(fā)酵罐中，調節(jié)pH值在7.0～7.4，控制溶氧指數(shù)在30％～40％。OD600≈2.5時啟動恒速補料，補料流速為1.25ml/min，共補料20xLB150ml。濕菌重顯著提高達36

6、.241g/L，目標蛋白表達率達到20.36％。④將pQE31-tls/JM109工程菌發(fā)酵培養(yǎng)物制備得到融合蛋白包涵體，將包涵體裂解液經(jīng)Ni-NTA親和純化后，進一步采用陰離子交換層析純化，獲得純度達90％的目標蛋白。⑤將純化好的重組H6-TLS蛋白質經(jīng)透析法復性，并采用BCA法蛋白質定量后，凍存?zhèn)溆谩?2.噬菌體PaP3推定末端酶大亞單位的實驗驗證：①在基因組末端cosN兩側分別設計-對引物，通過PCR擴增出含有末端酶大亞單

7、位剪切位點的1050bp片段，并將之連接至T載體構建出底物質粒pMD-cos。②在含有Mg2+和K+的緩沖液中，200μg重組H6-TLS與20ng的pMD-cos底物質粒在37℃作用3小時，電泳結果顯示重組H6-TLS蛋白可將底物質粒部分線性化。③合成并用生物素標記基因組末端cosN位點20bp的寡核苷酸，定量后凍存?zhèn)溆?。將重組蛋白H6-TLS與cosN進行EMSA實驗后發(fā)現(xiàn)，在含有10mmol/L，CaCl2的緩沖液中，H6-TLS

8、蛋白可以與cosN。結合，與未加入H6-TLS蛋白的對照相比，結合H6-TLS蛋白后的cosN片段明顯滯后，說明了重組H6-TLS具有特異性結合DNA片段的能力。④利用超微量ATP酶檢測試劑盒未能檢測到重組H6-TLS蛋白質的ATP酶活性。 3.噬菌體PaP3末端酶大亞單位的分泌型表達及部分酶學活性的初步研究：①利用PCR從噬菌體PaP3基因組上擴增出末端酶大亞單位tls全長基因。②將tls全長基因插入分泌型表達載體pET22(

9、b)+，轉化大腸桿菌BL21(DE30)，成功構建pET22(b)-tls/BL21(DE30)工程菌。在1.2μg/ml氯霉素和100μg/mlAMP抗生素下，以0.05mol/L，終濃度的IPTG，25℃過夜誘導，目的蛋白可實現(xiàn)分泌型表達，全部存在于超聲裂解的上清中。經(jīng)Ni-NTA親和純化后，可從菌液上清中分離到重組TLS-6H融合蛋白質，純度達80％以上。③利用化學發(fā)光法，可檢測到TLS-6H的ATP酶活性，且為DNA非依賴性。④

10、經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)分泌型表達的TLS-6H蛋白質較高的核酸內(nèi)切酶活性，且該酶最佳反應條件為pH8.0，50mmol/LMg2+，50mmol/LK+，37℃，1h；其活性不被ATP和精脒增強。 4.噬菌體PaP3末端酶小亞單位基因PaP3p01的推定與功能研究：①通過基因排列順序，蛋白質保守性結構域和二級結構的分析，初步確定PaP3p01為推定小亞單位編碼基因tss(terminasesmallsubunit)。②利用PCR從噬菌體Pa

11、P3基因組上擴增出PaP3p01全長基因。③將推定tss基因連接至pQE31表達載體上，轉化大腸桿菌JM109，獲得表達穩(wěn)定的pQE31-tss/JM109工程菌。該工程菌目的蛋白表達量達總菌體含量25.8％，且以可溶性狀態(tài)存在于宿主菌JM109的胞漿中。③經(jīng)Ni-NTA親和層析純化及分子篩脫鹽后，獲得純度達90％的目的蛋白。④經(jīng)分析確定基因組末端左右各100bp共239bp為小亞單位結合靶DNA片段，并進行3’端生物素標記。⑤通過EM