通過RNA-seq初步考察銅綠假單胞菌噬菌體PaP3對(duì)宿主轉(zhuǎn)錄組的全局性調(diào)控作用.pdf

1、銅綠假單胞菌是一種革蘭氏陰性菌,屬于假單胞菌科,普遍存在于水和土壤中,為典型的人類條件致病菌,其感染可發(fā)生于呼吸道,尿道,燒傷和創(chuàng)傷等[1]。由于對(duì)多種抗生素都具有抵抗力,銅綠假單胞菌成為重要的醫(yī)院內(nèi)病原菌[2]。銅綠假單胞菌不僅含有自己的藥物抗性基因,還能從其他細(xì)菌獲取抗性基因[3]。多年來,已有大量研究致力于闡明銅綠假單胞菌的致病性和耐藥性,自基因組測(cè)序技術(shù)開始,這些研究逐步從傳統(tǒng)的以單一細(xì)菌毒力決定簇為核心的致病性研究轉(zhuǎn)向大規(guī)模的

2、全基因組分析。
　　標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)AO1是第一株被測(cè)序的銅綠假單胞菌,最顯著的特征是其基因組為細(xì)菌中最大的基因組之一,包含了6260,000個(gè)堿基對(duì)和90％的蛋白編碼基因,此外還含有與酵母菌細(xì)胞相當(dāng)?shù)?570個(gè)開放閱讀框。這種基因組的復(fù)雜性正是銅綠假單胞菌在各種復(fù)雜環(huán)境下生存繁殖并對(duì)耐受多種抗生素的原因所在[4]。PA3是由本科室從燒傷科分離得到的一株銅綠假單胞菌,其基因組的特征與PAO1相似。RNA-seq技術(shù)使我們能夠動(dòng)態(tài)地觀測(cè)銅綠

3、假單胞菌的基因組對(duì)各種刺激的反應(yīng)。從而我們能可以進(jìn)一步分析研究多個(gè)野生株和銅綠假單胞菌的臨床分離株的基因組特征及存在于不同的菌株之間的核心基因成分,并且還能弄清那些在特殊環(huán)境下對(duì)細(xì)菌的生存具有促進(jìn)作用的基因,而這些基因的表達(dá)都是由轉(zhuǎn)錄調(diào)控子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄所控制的。并且PAO1有10%的基因組屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)控子,這再一次提示銅綠假單胞菌的基因表達(dá)是在轉(zhuǎn)錄調(diào)控子的緊密調(diào)控下完成的。
　　噬菌體作為一種寄生生物,與宿主菌共存,能利用宿主菌的大分

4、子合成裝置進(jìn)行復(fù)制,這一過程涉及了眾多調(diào)控機(jī)制[5]。噬菌體需要在轉(zhuǎn)錄水平上控制宿主菌的多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控子,使有利于噬菌體復(fù)制的基因表達(dá),其他無關(guān)的基因則被抑制[6]。本課題通過基于Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)的RNA-seq技術(shù)對(duì)來源于銅綠假單胞菌噬菌體PaP3感染宿主菌PA3后五個(gè)時(shí)間點(diǎn)的總轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了序列測(cè)定,通過生物信息學(xué)分析鑒定出差異表達(dá)基因并對(duì)其進(jìn)行了GO功能及KEGGPathway顯著富集性分析,同時(shí)對(duì)新轉(zhuǎn)錄本,非翻譯區(qū)(U

5、ntranslatedRegions,UTRs),啟動(dòng)子和非編碼小RNA(sRNA)進(jìn)行了檢測(cè)及初步分析,全面快速地獲取了銅綠假單胞菌噬菌體PaP3對(duì)其宿主菌PA3轉(zhuǎn)錄組全局性調(diào)控的基本信息。本研究的主要內(nèi)容及結(jié)果包括以下幾個(gè)方面:
　　1.銅綠假單胞菌PA3被噬菌體PaP3感染后的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序評(píng)估:測(cè)序所得的Reads能夠比對(duì)到參考基因組和參考基因序列的平均比例分別為94.09%和61.25%;通過減法雜交的rRNA平均去除率高達(dá)

6、99.6%,去除雜質(zhì)后的cleanreads比對(duì)到參考基因組和參考基因上的比例符合覆蓋整個(gè)基因組和轉(zhuǎn)錄組的要求?；蚋采w度在70%-100%的Reads平均為4298條,占所有測(cè)序基因的80%。RNA打斷的隨機(jī)性好,Reads在基因的各個(gè)部位分布比較均勻,所測(cè)數(shù)據(jù)符合后續(xù)基因表達(dá)注釋的標(biāo)準(zhǔn)。
　　2.銅綠假單胞菌PA3被噬菌體PaP3感染后的基因動(dòng)態(tài)表達(dá)分析:根據(jù)RPKM表達(dá)量算法共得到5536個(gè)差異表達(dá)基因,其中5466個(gè)為PA

7、3的基因,70個(gè)為PaP3的基因。PA3的差異表達(dá)基因歸屬于27條PseudoCAP功能注釋,KEGGPathway顯著性富集分析涉及了31條代謝路徑。分析發(fā)現(xiàn),被PaP3感染后PA3中87.5%的σ因子、81.5%的必需基因和86.5%的核心基因出現(xiàn)差異表達(dá)。PA3的差異基因中有4174個(gè)基因下調(diào)表達(dá),這些下調(diào)基因絕大多數(shù)受細(xì)菌全局性調(diào)控系統(tǒng)調(diào)節(jié)。利用VFBD數(shù)據(jù)庫比對(duì)顯示,76.5%已注釋毒力相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)。可見,噬菌體PaP3可

8、能通過抑制宿主菌PA3轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān)基因而對(duì)宿主的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行全局性的調(diào)控。
　　3.銅綠假單胞菌PA3的轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)及5'非翻譯區(qū)(5'UTRs)分析:我們分別對(duì)PA3被噬菌體感染后不同時(shí)間點(diǎn)的六個(gè)樣本的轉(zhuǎn)錄本(TUs)進(jìn)行了TSS檢測(cè),所檢測(cè)的TUs、SD序列以及Rho-independent終止子數(shù)目在各樣本中基本一致,每個(gè)樣本平均檢測(cè)到3570個(gè)TUs、1834個(gè)SD序列和322個(gè)終止子。確定了TUs的5’端以及其下游基因的5’

9、UTR,統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)50%5’UTR以上的長(zhǎng)度都集中在200nt以下的范圍。PA3被PaP3感染的不同時(shí)期,所測(cè)的5’UTR總量基本沒有變化。而在長(zhǎng)度分布上,200nt以下的5’UTRs變化顯著。我們推測(cè),在PA3中發(fā)揮調(diào)控作用的主要是長(zhǎng)度在200nt以下的5’UTRs,PaP3可能會(huì)作用于這些小于200nt的5’UTR而調(diào)控宿主的基因轉(zhuǎn)錄。
　　4.銅綠假單胞菌PA3被噬菌體PaP3感染后的sRNA表達(dá)的研究:銅綠假單胞菌中已注釋的

10、19種sRNA在本研究中均出現(xiàn)了差異表達(dá)。有9種在五個(gè)時(shí)間點(diǎn)中均下調(diào)表達(dá),僅P18和P34在整個(gè)過程表達(dá)上調(diào)。除上述已注釋的sRNA基因外,我們還檢測(cè)出1329個(gè)新的候選sRNA,統(tǒng)計(jì)出其中有意義的差異表達(dá)的候選sRNA91種:50種上調(diào),41種下調(diào)。提示這些sRNA可能與噬菌體的感染及細(xì)菌的抵抗有關(guān),但需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及深入的功能分析。
　　綜上所述,利用直接的高通量cDNAs測(cè)序方法(RNA-seq)分析發(fā)現(xiàn),銅綠假單胞菌噬