銅綠假單胞菌噬菌體PaP4的分離鑒定及其基因組序列解析.pdf

1、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)為革蘭氏陰性桿菌,是目前臨床上造成醫(yī)院內(nèi)感染的最重要的機會致病菌之一。該菌本身對許多抗生素天然不敏感,并且隨著抗生素的大量使用,銅綠假單胞菌對原本敏感的抗生素也產(chǎn)生了耐藥性。因此,在臨床上對銅綠假單胞菌感染的治療,尤其是對多重耐藥菌株感染的治療成為非常棘手的問題。在此背景下,人們把目光轉(zhuǎn)向了噬菌體的治療潛力。噬菌體是一類廣泛存在于自然界中的可感染細菌的病毒,其數(shù)量龐大,約為

2、細菌的10倍(>1031)。據(jù)統(tǒng)計,截止到2013年3月,已有921株噬菌體被報道完成全基因組測序。它于1915年由FrederickW.Twort研究發(fā)現(xiàn),而1919年就將其作為抗菌物質(zhì)進行實驗研究。之后對于噬菌體的研究一直在繼續(xù),研究者相繼鑒定了多種細菌的不同噬菌體,在噬菌體治療方面也取得了許多顯著成績。然而,噬菌體作為一種抗感染治療手段迄今沒能在臨床推廣應(yīng)用。就其原因,最重要的是我們對噬菌體這一生命現(xiàn)象的認識還不夠,尤其是對擴展噬

3、菌體宿主譜、提高噬菌體治療制劑的廣譜性方面還缺乏有效突破口。因此,新發(fā)現(xiàn)并鑒定不同的噬菌體仍然是非常重要的工作,這將為噬菌體治療的發(fā)展打下必要的基礎(chǔ)。
　　本文以銅綠假單胞菌的一株臨床分離株P(guān)A1作為宿主譜,從西南醫(yī)院的污水中分離到1株噬菌體,命名為PaP4。首先通過最佳感染復(fù)數(shù),一步生長曲線和結(jié)構(gòu)蛋白對其生物學(xué)特性進行了研究分析;其次提取基因組DNA送至北京華大基因研究中心進行全基因組測序,并通過實驗將噬菌體PaP4的全基因組鑒

4、定為環(huán)狀;進而對基因組進行了初步注釋并提交序列到GenBank。最后通過生物信息學(xué)比對分析,證實噬菌體PaP4屬于LUZ24-like噬菌體家族成員。研究內(nèi)容及結(jié)果主要包括以下幾個方面。
　　1.宿主菌銅綠假單胞菌PA1的背景。PA1為新橋醫(yī)院檢驗科分離的臨床分離株,用成都生物制品研究所提供的分群血清鑒定為第11群,本實驗室保存并長期對其進行研究,目前已對其完成了全基因組測序(GenBankNo.CP004054)。
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5、.以銅綠假單胞菌PA1為宿主菌,采用混合宿主菌擴增噬菌體的方法,從西南醫(yī)院污水中分離到1株具有透明噬斑的裂解性噬菌體,命名為PaP4。噬菌體基因組經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定為dsDNA。通過終點滴定法可知該噬菌體滴度為8×1010。樣品染色后,用電鏡觀察發(fā)現(xiàn)PaP4有一個多面體立體對稱的頭部,直徑約為50nm,并有一個約30nm的短尾,形態(tài)學(xué)上屬于短尾科噬菌體。由感染復(fù)數(shù)實驗得出噬菌體PaP4感染其宿主菌PA1的最佳感染復(fù)數(shù)是0.001。根

6、據(jù)一步生長曲線可知,噬菌體PaP4感染宿主菌的潛伏期約為20min,爆發(fā)期約為20min,爆發(fā)量約為150。SDS-PAGE蛋白電泳分析發(fā)現(xiàn),在中分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準范圍內(nèi),凝膠上至少出現(xiàn)了7條蛋白條帶,表明噬菌體PaP4中至少含有7個結(jié)構(gòu)蛋白。
　　3.將噬菌體PaP4基因組DNA提取純化后送至華大基因北京研究中心對其進行全基因組測序。經(jīng)BLAST比對檢索,確定噬菌體PaP4為一株全新噬菌體。同時用全覆蓋PCR擴增的方法,確定了其序

7、列的正確性。利用基因組的實際酶切圖譜和電子酶切圖譜的比較方法,最終將PaP4全基因組鑒定為環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
　　4.噬菌體PaP4基因組的一般概況。①基因組測序表明該基因組全長為43,895bp,通過軟件分析其堿基組成是:A=24.29％,G=26.44%,C=26.02%,T=23.25%,G+C=52.46%,明顯的低于其宿主菌PA1的G+C含量(66.3%)。②噬菌體PaP4的基因組序列中未發(fā)現(xiàn)tRNA基因。
　　5.基因組

8、的生物信息學(xué)分析以及基因功能的探討。噬菌體PaP4全基因組具有264個大于100bp的ORFs,其中70個預(yù)測為編碼基因,編碼序列總長度為41,525bp,基因的平均DNA長度為627bp。在整個基因組DNA中,平均每1000bp長度中有1.63個推定基因,基因組中堿基的使用率達到94.6%。使用蛋白質(zhì)序列對蛋白質(zhì)序列的比對工具,在國際公共數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了18個同源蛋白質(zhì)。
　　6.通過基因組比對發(fā)現(xiàn),噬菌體PaP4全基因組與LUZ

9、24-like家族噬菌體的基因組相似性非常高(92%~76%)。進而,利用MEGA軟件工具對搜索到的具有顯著相似性的基因進行多重比對,通過phylip軟件繪制系統(tǒng)發(fā)生樹,用TreeView軟件觀察結(jié)果。并通過CoreGenes的蛋白相關(guān)性分析最終證實噬菌體PaP4屬于LUZ24-like噬菌體家族的新成員。
　　噬菌體PaP4的全基因組序列已經(jīng)在GenBank登錄(No.KC294142)
　　綜上所述,通過本研究,明確了新

10、分離的一株銅綠假單胞菌噬菌體PaP4的基本生物學(xué)特性及其全基因組生物信息學(xué)特性,并對該基因組進行了初步注釋。PaP4成為繼本室分離鑒定的PaP1,PaP2和PaP3之后的第四株銅綠假單胞菌噬菌體。并通過對這4株噬菌體生物學(xué)特性及基因組學(xué)特性的比較,進一步揭示了噬菌體的生物多樣性,為全面深入地認識噬菌體的遺傳與變異、進化與分類、基因組織與調(diào)控以及寄生機制等生物學(xué)特性中的重大問題提供了新的數(shù)據(jù)。同時,注釋結(jié)果表明PaP4屬于LUZ24-li