銅綠假單胞菌GF31氯氰菊酯降解酶的基因克隆及原核表達(dá).pdf

1、擬除蟲菊酯是從天然除蟲菊素經(jīng)歷兩代發(fā)展而成的一類高效、廣譜性殺蟲劑;由于其大量使用給生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來危害而亟待治理;微生物降解是目前比較有效降解擬除蟲菊酯的途徑。
　　近些年來國內(nèi)外關(guān)于擬除蟲菊酯降解的研究大多集中在降解微生物的篩選、降解特性和降解途徑的研究等方面;關(guān)于降解酶基因的克隆、表達(dá)、分子改造和降解機(jī)理的研究還不夠深入。
　　本研究以實(shí)驗(yàn)室保存的一株具有擬除蟲菊酯降解能力的銅綠假單胞菌Pseudomonas a

2、eruginosa GF31為研究對(duì)象，根據(jù)前期純化獲得的氯氰菊酯降解酶的氨基酸序列，通過NCBI數(shù)據(jù)庫搜索同源序列，確定以同源性最高的PAO1假定的氨肽酶序列為模板設(shè)計(jì)引物，從GF31中克隆氯氰菊酯降解酶基因，命名為APs。通過SMART數(shù)據(jù)庫分析APs基因編碼的氨基酸序列，按照該蛋白的不同結(jié)構(gòu)片段進(jìn)行克隆，分別是ORF(全長基因)、SgI(去信號(hào)肽和前導(dǎo)肽的成熟蛋白)、PA（保留Pfam及Peptidase結(jié)構(gòu)域）、Pep(Pept

3、idase)，基因片段大小分別為:1611bp、1503bp、1014bp和645bp。通過與載體pET28a/pET30a/pET32a構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)、Rosseta(DE3)、Rosseta-gami成功構(gòu)建了基因工程菌。
　　對(duì)構(gòu)建的工程菌表達(dá)氯氰菊酯降解酶的情況進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)該酶在BL21(DE3)、Rosseta(DE3)中以包涵體形式表達(dá)，在Rosseta-gami中以可溶形式融合表達(dá);

4、通過鎳柱親和層析對(duì)氯氰菊酯降解酶進(jìn)行了純化和酶活測定，結(jié)果顯示SgI片段編碼的蛋白24h對(duì)氯氰菊酯的降解率為12.7％。該酶為蛋白酶其中的氨肽酶，經(jīng)過測定，對(duì)底物L(fēng)-亮氨酸-對(duì)硝基苯胺(Leu-pNA)的比活力為1255.2U/mg。
　　為了研究目的基因的表達(dá)水平，制備了目的基因APs和內(nèi)參基因16S rRNA的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，按10倍梯度稀釋測定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2＞0.99，擴(kuò)增效率=90～110％，成功建立了相對(duì)