MicroRNA-10b在NPM1突變急性髓系白血病細(xì)胞分化阻滯中的作用探討.pdf

1、第一部分探討NPM1基因突變對(duì)急性白血病細(xì)胞分化的影響
　　 核仁磷酸蛋白基因（nucleophosmin，NPM1）突變?cè)诩毙运柘蛋籽〉陌l(fā)生發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)控作用，而與白血病分化阻滯的關(guān)系尚未闡明。為探討NPM1突變基因?qū)Π籽〖?xì)胞體外分化的影響，將攜帶NPM1A型突變（NPM1-mA）的表達(dá)質(zhì)粒載體pEGFPC1-NPM1-mA轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞系，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)NPM1突變蛋白的細(xì)胞株(THP-1 mA)，同時(shí)設(shè)立野

2、生型NPM1轉(zhuǎn)染組(THP-1 wt)、空載體轉(zhuǎn)染組(THP-1 C1)及未處理組(THP-1)為對(duì)照。通過(guò)RT-PCR、Western blot及免疫細(xì)胞化學(xué)驗(yàn)證THP-1 mA細(xì)胞株的構(gòu)建。利用PMA誘導(dǎo)各組細(xì)胞分化，瑞氏-吉姆薩染色觀(guān)察細(xì)胞分化的形態(tài)改變，計(jì)算貼壁細(xì)胞率;流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面分化抗原CD14的表達(dá)。結(jié)果顯示，成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)NPM1突變蛋白的THP-1 mA細(xì)胞株。PMA作用72 h后，與對(duì)照組相比，THP-1

3、mA組細(xì)胞的分化形態(tài)學(xué)改變不顯著，貼壁細(xì)胞數(shù)明顯降低(P＜0.05);同時(shí)，CD14的表達(dá)受到顯著抑制(P＜0.01)。提示NPM1突變能夠阻滯白血病細(xì)胞系的體外分化。、
　　 第二部分MicroRNA-10b通過(guò)調(diào)控鋅指蛋白KLF4阻滯白血病細(xì)胞分化
　　 探討microRNA-10b(miR-10b)通過(guò)抑制鋅指蛋白Krüppel-likefactor4(KLF4)的表達(dá)對(duì)急性白血病細(xì)胞分化的影響。雙熒光素酶報(bào)告基因

4、試驗(yàn)及Western blot驗(yàn)證KLF4為has-miR-10b的功能靶基因之一;qPCR及Western blot分別檢測(cè)不同分化程度的白血病細(xì)胞系中miR-10b與KLF4的表達(dá);1，25-二羥基維生素D3(1，25D3)誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞系HL60向單核系分化，檢測(cè)此過(guò)程中miR-10b及KLF4的表達(dá)變化;利用體外合成的寡核苷酸(has-miR-10b mimics)轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞，瑞氏-吉姆薩染色觀(guān)察1，25D3誘導(dǎo)后細(xì)胞分

5、化形態(tài)學(xué)的改變，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單核細(xì)胞表面標(biāo)志CD14的表達(dá)。結(jié)果顯示，KLF4為has-miR-10b的功能靶基因;miR-10b在分化早期的KG-1a細(xì)胞中表達(dá)最高，在分化較晚期的U937、THP-1細(xì)胞中表達(dá)最低(P＜0.01)，而KLF4的表達(dá)與之相反;經(jīng)1，25D3誘導(dǎo)HL60向單核系分化過(guò)程中，miR-10b的表達(dá)呈時(shí)間依賴(lài)性降低，KLF4則逐漸增高;HL60細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-10b后可抑制1，25D3誘導(dǎo)的細(xì)胞分化形態(tài)學(xué)

6、的改變及CD14的表達(dá)(P＜0.05)。提示miR-10b通過(guò)負(fù)調(diào)控KLF4的表達(dá)阻滯白血病細(xì)胞HL60向單核系分化。、
　　 第三部分MicroRNA-10b參與阻滯NPM1突變的白血病細(xì)胞分化
　　 NPM1突變可引起骨髓增生的異常，然而AML的發(fā)生還須合并其他損傷因素。miRNA調(diào)控作為重要的表觀(guān)遺傳學(xué)調(diào)控之一，在白血病發(fā)生中發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步探討miR-10b失調(diào)是否參與調(diào)控NPMc+AML細(xì)胞分化，qPCR

7、及Western blot分別檢測(cè)THP-1 mA及OCI/AML3細(xì)胞中miR-10b與KLF4的表達(dá);利用體外合成的反義寡核苷酸(has-miR-10b inhibitor)轉(zhuǎn)染OCI/AML3細(xì)胞，檢測(cè)KLF4蛋白的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單核細(xì)胞表面標(biāo)志CD14的表達(dá)情況。結(jié)果表明，THP-1 mA細(xì)胞中miR-10b表達(dá)明顯增高(P＜0.05)，同時(shí)KLF4蛋白表達(dá)水平下降;在攜帶有NPM1A型突變的白血病細(xì)胞系OCI/AML3中