魚藤素靶向Mt NPM1-SIRT1軸——誘導NPMc+急性髓系白血病細胞分化機理的研究.pdf

1、目的：核磷蛋白（NPM1），是一種低聚核仁磷酸蛋白，定位于核仁，穿梭于核漿之間，在維持核仁結構，DNA修復，轉錄調節(jié)，組蛋白伴侶活性等起著重要的作用。NPM1高表達于增殖活躍的細胞如干細胞和腫瘤細胞，其突變導致NPM1蛋白C末端氨基酸肽的改變，減弱了核定位信號，使NPM1異常胞漿定位，帶動和NPM1相互作用的蛋白或轉錄因子也異常定位于胞漿，造成細胞生物學功能的紊亂，引發(fā)癌癥發(fā)生和進展。NPM1基因突變發(fā)生在約60％核型正常的急性髓系白血

2、病患者，是AML中檢出率最高的分子學異常，成為NPMc+AML發(fā)病的重要因素。盡管造血干細胞移植聯(lián)合化療的改進極大促進了AML的治療，然而仍不能治愈。然而誘導分化治療的策略改變了某些AML亞型的結局，如亞砷酸，維甲酸治療AML-M3（具有PML-RARα融合基因），明顯提高了緩解率和疾病生存期。白血病的誘導分化治療亦成為研究熱點。因此，研發(fā)高效且副作用小的藥物是急性髓系白血病治療的另一有效途徑。魚藤素是我們課題組先后承擔兩項國家自然科學

3、基金面上項目基礎上篩選出的具有調控白血病細胞核孔蛋白及核磷蛋白表達和功能的天然單體藥物，我們首次發(fā)現(xiàn)高劑量魚藤素能活化凋亡信號通路，誘導NPMc+AML細胞凋亡，低劑量時，誘導分化，然而其促分化機制尚不明確。本實驗對此進行了有關研究。
　　方法：以NPMc+AML體外實驗的細胞模型OCI-AML3細胞（攜帶突變NPM1蛋白）為研究對象，以OCIM2細胞作為陰性對照（攜帶野生型NPM1），采用MTT，LDH釋放實驗及臺盼藍染色檢測魚

4、藤素干預后的細胞增殖抑制率及活性改變。流式細胞計數(shù)檢測細胞凋亡及細胞表面分化標記（CD11b/CD14/CSF-3R）的表達。瑞氏-吉姆薩染色檢測分化細胞形態(tài)學特征；硝基四氮唑藍（NBT）還原試驗檢測具有還原活性的分化細胞比例；Western blot蛋白免疫印跡技術及實時定量聚合酶鏈反應檢測Mt NPM1，Wt NPM1，HDAC1，HDAC3，SIRT1，C/EBPβ及G-CSFR的蛋白及mRNA表達水平；免疫蛋白共沉淀技術（IP）

5、檢測Mt NPM1泛素化水平改變；20S酶活性試劑盒檢測魚藤素處理后細胞20S蛋白酶活性；慢病毒si-RNA介導的基因沉默技術沉默Mt NPM1及SIRT1后，探索Mt NPM1和SIRT1的關系，檢測C/EBPβ及G-CSFR的蛋白及mRNA表達水平；構建慢病毒Mt NPM1過表達載體轉染OCI-AML3細胞后，檢測魚藤素干預后細胞表面分化抗原及分化蛋白的表達變化。
　　結果：魚藤素以濃度依賴方式抑制了NPM1突變細胞系OCI-

6、AML3細胞增殖，誘導凋亡，而對NPM1野生型細胞系OCIM2細胞誘導凋亡作用不明顯；魚藤素在非毒性劑量（2μM）/長時間（5d）作用下，誘導OCI-AML3細胞分化，而對OCIM2細胞無促分化作用。非毒性劑量魚藤素顯著下調Mt NPM1，SIRT1，HDAC1，HDAC3的表達，上調C/EBPβ及G-CSFR的蛋白及mRNA表達，而不影響Wt NPM1蛋白表達。魚藤素通過泛素蛋白酶體途徑降低Mt NPM1水平，而在翻譯后水平誘導SIR

7、T1的下調。si-NPM Mut干預OCI-AML3細胞后，可下調SIRT1蛋白水平，促進細胞分化，同時也上調C/EBPβ及G-CSFR的蛋白表達，而不改變HDAC1/HDAC3水平；而si-SIRT1干預OCI-AML3細胞后，沒有改變Mt NPM1蛋白水平，但促分化效應和si-NPM Mut干預類似，說明Mt NPM1下調引起的促分化效應部分和SIRT1的下調相關；最后，同轉染對照慢病毒相比，Mt NPM1過表達于OCI-AML3細