魚藤素和冬凌草甲素靶向NPM1突變蛋白——治療NPMc+急性髓系白血病作用機理研究.pdf

1、第一部分魚藤素特異性下調(diào)NPM1突變蛋白促進NPMc+急性髓系白血病的凋亡及誘導(dǎo)分化
　　目的:核磷蛋白(NPM1)是一種廣泛存在于細胞核內(nèi)的磷酸蛋白,穿梭于核仁、核質(zhì)和胞漿之間,具有多種生物學(xué)功能。在接近1/3的急性髓系細胞白血病患者中,NPM1蛋白突變導(dǎo)致NPM1異常的胞漿聚集,是NPMc+AML發(fā)病的重要原因。本實驗主要研究魚藤素(deguelin)對急性髓系細胞白血病(AML)細胞OCI-AML3(具有NPM1蛋白突變)及

2、OCIM2(NPM1野生型)的細胞凋亡,細胞分化,NPM1野生型蛋白,NPM1突變型蛋白的影響,探討其抗腫瘤機制。
　　方法:采用MTT比色法及臺盼藍染色法檢測魚藤素作用后AML細胞OCI-AML3及OCIM2細胞的增殖及活性;AnnexinV-FITC/PI雙染法流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡;瑞氏-吉姆薩染色,CD11b,CD14分化抗原流式細胞術(shù)檢測細胞分化;分光光度法檢測Caspase-6和Caspase-8活性;Westernb

3、lot免疫印跡技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白PARP,Caspase3的表達,分化相關(guān)蛋白p53,p21,C/EBPα的表達以及NPM1總蛋白,野生型及突變型蛋白的表達水平;siRNA特異性沉默OCI-AML3細胞NPM1突變蛋白,檢測OCI-AML3細胞增殖,細胞分化及分化相關(guān)蛋白的表達情況;
　　結(jié)果:魚藤素對NPMc+的AML細胞OCI-AML3具有明顯抑制作用,可顯著下調(diào)NPM1突變蛋白的表達,而冬凌草甲素,雷公藤內(nèi)酯醇及白樺脂酸對

4、OCI-AML3NPM1突變蛋白及野生型蛋白表達均無影響;在高濃度情況下,魚藤素可明顯促進OCI-AML3細胞的凋亡,OCI-AML2相對不敏感,OCI-AML3的凋亡伴隨有Caspase-6,Caspase-8活性上調(diào),NPM-mut蛋白特異性下調(diào);而在低濃度情況下,魚藤素則可誘導(dǎo)OCI-AML3細胞分化,對無NPM1突變OCIM2細胞無此作用,該分化作用可能與Caspase-8活性升高,p53,p21及30kDC/EBPα表達水平下

5、降有關(guān)。SiNPM-mut沉默OCI-AML3,可抑制細胞增殖并促進細胞分化,并可下調(diào)p53,p21及30kDC/EBPα蛋白表達,激活Caspase-8活性。
　　結(jié)論:與NPM1未突變急性白血病相比,OCI-AML3對魚藤素最為敏感;高濃度魚藤素能夠明顯抑制OCI-AML3細胞的增殖,并能誘導(dǎo)凋亡,這可能與NPM1突變蛋白的表達下調(diào),Caspase-6,Caspase-8活性上調(diào)有關(guān);而低濃度魚藤素可特異性誘導(dǎo)OCI-AML3

6、細胞的分化,該分化作用與NPM1突變蛋白下調(diào),p53,p21及30kDC/EBPα蛋白表達,Caspase-8活性激活有關(guān)。
　　第二部分冬凌草甲素對NPMc+急性髓系白血病NPM1突變蛋白異常定位的調(diào)節(jié)作用
　　目的:本實驗主要研究冬凌草甲素對NPMc+AML細胞OCI-AML3細胞增殖,細胞凋亡,核磷蛋白NPM1野生型,突變型蛋白表達及定位的影響,同時研究核孔蛋白98及Crm1表達及定位情況,探討其抗腫瘤機制。
　

7、　方法:采用MTT比色法檢測冬凌草甲素作用后NPMc+細胞OCI-AML3的增殖活性,AnnexinV-FITC/PI雙染法流式細胞術(shù)及Hoechst33258檢測細胞凋亡,Westernblot免疫印跡技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3,PARP蛋白及p14arf、p53的表達,NPM1突變及野生型蛋白,Nup98,Crm1表達水平和漿核分布情況;RT-PCR分別檢測Nup98基因水平,免疫熒光共聚焦觀察NPM1突變蛋白、NPM1

8、野生型蛋白和Nup98的亞細胞定位和表達。
　　結(jié)果:冬凌草甲素能明顯抑制NPMc+OCI-AML3細胞的增殖,其抑制作用呈時間、劑量依賴性;能誘導(dǎo)細胞凋亡;促進NPM1突變蛋白向胞核轉(zhuǎn)位;上調(diào)p14arf及p53的表達;經(jīng)冬凌草甲素干預(yù)后,OCI-AML3細胞Nup98mRNA及蛋白水平均明顯上調(diào),并伴有明顯的Nup98核內(nèi)轉(zhuǎn)位;冬凌草甲素對Crm1蛋白表達無影響,可使其向核內(nèi)轉(zhuǎn)位;
　　結(jié)論:冬凌草甲素能夠明顯抑制NPM