NPM1突變蛋白介導(dǎo)核蛋白PML異常定位及穩(wěn)定性促進(jìn)白血病細(xì)胞的自噬和增殖能力.pdf

1、目的：
　　急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia,AML）是一組臨床上細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)具有高度異質(zhì)性的惡性血液病。核仁磷酸蛋白（nucleophosmin,NPM1）基因突變是AML最常見(jiàn)的一種基因突變。已有的文獻(xiàn)報(bào)道NPM1基因突變是白血病發(fā)生的始動(dòng)因素。然而，NPM1突變基因促進(jìn)AML惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制仍尚未完全闡明。自噬是真核細(xì)胞中比較保守的一種代謝途徑，通過(guò)溶酶體途徑降解胞內(nèi)折疊錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)或

2、受損的細(xì)胞器以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。越來(lái)越多的證據(jù)表明自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和治療療效密切相關(guān)。此外，最新臨床研究顯示，NPM1突變陽(yáng)性AML樣本中存在腫瘤抑制因子早幼粒細(xì)胞白血病蛋白PML異常的亞細(xì)胞定位。本文主要探討NPM1基因突變對(duì)白血病細(xì)胞自噬的調(diào)控作用，進(jìn)一步觀察自噬水平的改變對(duì)NPM1突變白血病細(xì)胞體外增殖的影響，并初步探討異常表達(dá)的PML蛋白在NPM1突變介導(dǎo)的白血病細(xì)胞自噬中的作用。
　　方法：
　　首先采用過(guò)表達(dá)和慢

3、病毒介導(dǎo)的RNA干擾方法，觀察A型NPM1基因突變（NPM1-mA）對(duì)白血病細(xì)胞自噬水平的調(diào)控作用，進(jìn)一步觀察自噬誘導(dǎo)劑rapamycin或抑制劑3-methyladenine（3-MA）處理對(duì)NPM1-mA介導(dǎo)的細(xì)胞體外增殖能力的影響。qRT-PCR和western blot檢測(cè)髓系白血病細(xì)胞株和臨床AML樣本中PML的表達(dá)水平；免疫組化和免疫熒光檢測(cè)PML蛋白在髓系白血病細(xì)胞中的分布情況。免疫共沉淀檢測(cè)NPM1突變蛋白與PML蛋白之

4、間的相互作用。過(guò)表達(dá)或者干擾NPM1-mA后觀察 PML蛋白水平的變化。Cycloheximide和MG132處理進(jìn)一步觀察NPM1-mA對(duì)PML蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控。接下來(lái)，利用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)下調(diào)PML水平，探討干擾PML對(duì)天然攜帶NPM1突變基因的OCI-AML3白血病細(xì)胞株的自噬、體外增殖能力以及AKT信號(hào)分子的改變。最后，通過(guò)rescue實(shí)驗(yàn)觀察過(guò)表達(dá)PML對(duì)NPM1-mA knockdown的OCI-AML3細(xì)胞株自噬

5、和體外增殖能力的影響。
　　結(jié)果：
　　首先，過(guò)表達(dá)NPM1-mA能夠增強(qiáng)THP-1白血病細(xì)胞株自噬水平，3-MA處理能夠減弱NPM1-mA介導(dǎo)的細(xì)胞體外增殖能力；相反，干擾 NPM1-mA則抑制OCI-AML3細(xì)胞自噬水平，而rapamycin處理能逆轉(zhuǎn)NPM1-mA knockdown介導(dǎo)的細(xì)胞體外增殖能力。其次，在NPM1-mA陽(yáng)性的AML樣本和OCI-AML3細(xì)胞株中證實(shí)了PML的表達(dá)和蛋白的異常胞質(zhì)定位。免疫共沉淀

6、驗(yàn)證了NPM1-mA蛋白與PML蛋白的相互作用。此外，過(guò)表達(dá)NPM1-mA能上調(diào)PML蛋白表達(dá)水平，干擾NPM1-mA則下調(diào)PML蛋白表達(dá)水平。Cycloheximide和MG132處理進(jìn)一步驗(yàn)證了 NPM1突變蛋白是通過(guò)抑制蛋白酶體途徑來(lái)增強(qiáng)PML蛋白的穩(wěn)定性。接著，干擾PML導(dǎo)致OCI-AML3體外增殖能力和克隆形成能力減弱。另外，干擾PML可抑制細(xì)胞自噬活性進(jìn)而影響細(xì)胞增殖能力，這可能與AKT信號(hào)分子的改變有關(guān)。最后，rescue