白藜蘆醇誘發(fā)組織蛋白酶D介導(dǎo)的耐藥性白血病細(xì)胞自噬性死亡.pdf

1、背景與目的：細(xì)胞自噬是一種將細(xì)胞內(nèi)容物運(yùn)送到溶酶體進(jìn)行降解的程序性細(xì)胞死亡方式，誘導(dǎo)或抑制自噬都會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞的死亡。目前研究者已經(jīng)證實(shí)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中自噬活性具有兩面性，既有促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，也有抑制腫瘤生長誘導(dǎo)其細(xì)胞死亡的作用，自噬與腫瘤的關(guān)系十分復(fù)雜，也存在著不少的分歧。本課題通過比較白血病多藥耐藥 K562/ADM細(xì)胞及其親本 K562細(xì)胞對(duì)植物抗毒素白藜蘆醇的敏感性，以及白藜蘆醇誘導(dǎo)的自噬活化與細(xì)胞凋亡作用，探討白藜

2、蘆醇誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞自噬活性與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，探討白藜蘆醇誘導(dǎo)耐藥性白血病細(xì)胞凋亡的自噬機(jī)制，為臨床克服白血病細(xì)胞耐藥性、提高耐藥性白血病細(xì)胞的藥物敏感性提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：MTT比色檢測藥物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制，透射電鏡和 MDC熒光染色觀察細(xì)胞自噬形態(tài)學(xué)的改變，Western-blotting檢測自噬相關(guān)蛋白 LC3、Beclin-1及P62的表達(dá)。FCM檢測細(xì)胞周期變化，流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡

3、率，Western-blotting和流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白 caspase-3、Bcl-2、Bax和細(xì)胞色素c（Cyt c）、組織蛋白酶D（Cath D）以及P-糖蛋白（P-gp）的表達(dá)，F(xiàn)CM檢測活性氧的變化水平。
　　結(jié)果：1. MTT實(shí)驗(yàn)表明，不同濃度的白藜蘆醇對(duì)白血病耐藥細(xì)胞K562/ADM及敏感細(xì)胞K562均具有增殖抑制作用。K562細(xì)胞48h的IC50值為46.67±0.38μmol/L，而K562/ADM細(xì)胞的

4、IC50值為57.71±0.67μmol/L，可以看出K562/ADM細(xì)胞對(duì)白藜蘆醇具有一定的耐受性。
　　2.透射電鏡和MDC熒光染色結(jié)果顯示，白藜蘆醇作用兩種細(xì)胞后胞內(nèi)自噬泡數(shù)目均明顯增多，核周的點(diǎn)狀熒光強(qiáng)度也增高，且 K562/ADM細(xì)胞較其親本K562細(xì)胞自噬泡增多明顯。WB檢測結(jié)果顯示不同濃度的白藜蘆醇作用細(xì)胞后， K562/ADM細(xì)胞中與對(duì)照組相比自噬標(biāo)志蛋白LC3、Beclin-1的表達(dá)明顯上調(diào)，而P62蛋白在72h

5、后表達(dá)不足對(duì)照組的三分之一；而敏感細(xì)胞K562內(nèi)LC3和Beclin1的表達(dá)量也有輕度上調(diào)，但低于耐藥細(xì)胞株，P62的表達(dá)變化不是很明顯。
　　3.白藜蘆醇誘導(dǎo)K562/ADM細(xì)胞和K562細(xì)胞發(fā)生凋亡。流式細(xì)胞儀檢測兩種細(xì)胞株的總凋亡率均明顯升高，并且呈濃度依賴性；細(xì)胞周期發(fā)生明顯變化， G0/G1期細(xì)胞逐漸增多，而S期細(xì)胞減少（P<0.05），且對(duì)K562細(xì)胞的周期阻滯作用更明顯；同時(shí)對(duì)凋亡相關(guān)分子的檢測也顯示藥物作用兩種細(xì)胞

6、后可促進(jìn)caspase-3的活化、降低Bcl-2/Bax比值，并伴有Cyt c釋放增加及ROS產(chǎn)生增多。這些結(jié)果與WB結(jié)果相一致。令人關(guān)注的是我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)Cathepsin D經(jīng)藥物作用后，在耐藥細(xì)胞K562/ADM中的表達(dá)顯著上調(diào)，72小時(shí)后的表達(dá)量已接近對(duì)照組的3倍；而敏感細(xì)胞K562中僅輕度上調(diào)。最后WB檢測結(jié)果顯示白藜蘆醇沒有降低耐藥細(xì)胞P-gp的表達(dá)。
　　4.自噬抑制劑氯喹（CQ）抑制自噬可以降低K562/ADM細(xì)胞

7、對(duì)白藜蘆醇的敏感性，流式細(xì)胞儀檢測顯示經(jīng)CQ預(yù)處理后，K562/ADM細(xì)胞的凋亡率明顯下降，而K562細(xì)胞的凋亡率略有上升；WB檢測結(jié)果顯示經(jīng)CQ預(yù)處理后自噬標(biāo)志蛋白 LC3、Beclin-1的表達(dá)較白藜蘆醇單獨(dú)作用組明顯下調(diào)，凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的活化降低，Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)的比值升高。
　　結(jié)論：1.白藜蘆醇可誘導(dǎo)K562敏感細(xì)胞和K562/ADM耐藥細(xì)胞自噬活性，且K562/ADM細(xì)胞被誘導(dǎo)的自噬活性明顯高

8、于K562細(xì)胞。
　　2.白藜蘆醇通過增強(qiáng)K562/ADM耐藥細(xì)胞的自噬活性而誘導(dǎo)其凋亡，白藜蘆醇的細(xì)胞毒效應(yīng)導(dǎo)致溶酶體膜通透性增加、Cath D釋放入胞質(zhì)、促進(jìn)Bax介導(dǎo)的線粒體膜通透性與細(xì)胞色素c的釋放增多、激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞自噬性凋亡。白藜蘆醇同樣誘導(dǎo)K562敏感細(xì)胞自噬和凋亡，但自噬活化只是細(xì)胞凋亡的伴隨現(xiàn)象。
　　3. K562/ADM耐藥細(xì)胞的固有ROS水平顯著低于K562敏感細(xì)胞，且白藜蘆