白藜蘆醇聯(lián)合蛋白酶體抑制劑對白血病的治療作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 白血病是一種造血系統(tǒng)的惡性病變,其主要表現(xiàn)為異常的白血病細(xì)胞及其幼稚細(xì)胞在骨髓及其他造血組織中進(jìn)行性的異常增生,發(fā)病機(jī)制目前尚不完全明確。
　　 泛素.蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)是真核生物體內(nèi)進(jìn)行蛋白選擇性降解的主要通路。由UPS介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解通路的嚴(yán)密調(diào)控在細(xì)胞周期中蛋白質(zhì)半衰期的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、抗原提呈、血管發(fā)生、以及移除錯誤折疊或受損的蛋白質(zhì)等過程中均發(fā)揮重要作用。研究表明,蛋白酶體抑制劑通過對泛素化通

2、路的阻斷可誘導(dǎo)多種包括白血病的人類腫瘤的細(xì)胞凋亡,是一類很有發(fā)展前途的抗腫瘤藥物。
　　 由于人工合成的化療藥物在治療腫瘤方面存在局限性,近年來一些從植物中提取的天然抗腫瘤藥物得到了科研界、醫(yī)療界的廣泛關(guān)注。白藜蘆醇是富含于葡萄皮、花生、紅酒等中的一種天然多酚類化合物,白藜蘆醇在抗腫瘤、抗炎、肝臟保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、心血管保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)等方面均發(fā)揮重要作用。已有大量報道表明,單獨應(yīng)用大劑量(通常大于50μmol/L)的白藜蘆醇能夠抑

3、制人類腫瘤細(xì)胞的生長。另外已有報道,白藜蘆醇聯(lián)合某些化療藥物治療腫瘤,不僅能夠降低化療藥物的毒副作用,而且能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。本研究探討蛋白酶體抑制劑單獨及聯(lián)合白藜蘆醇在白血病細(xì)胞凋亡過程中的影響作用。
　　 方法：
　　 1、單獨使用MG132或聯(lián)合白藜蘆醇處理白血病細(xì)胞
　　 2、MTT法檢測細(xì)胞活力
　　 3、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期
　　 4、蛋白印跡法檢測蛋白PA

4、RP剪切水平
　　 5、實時定量PCR和蛋白印跡法檢測p27Kipl和FOXO1的表達(dá)水平
　　 6、染色質(zhì)免疫沉淀法檢測結(jié)合到p27Kipl啟動子的FOXO1水平
　　 結(jié)果：
　　 一、白藜蘆醇能夠?qū)筂G132對K562的細(xì)胞毒性效應(yīng)
　　 MTT結(jié)果顯示1-20μmol/L的白藜蘆醇對K562細(xì)胞活力無影響,而大于50μmol/L能使細(xì)胞活力明顯下降;K562細(xì)胞活力對MG132呈劑量依賴

5、性下降;白藜蘆醇能夠?qū)筂G132呈劑量依賴性誘導(dǎo)的細(xì)胞活力變化,2μmol/L具有明顯的抑制效應(yīng),5-20μmol/L顯示出最大效應(yīng);即使選用毒性劑量(50-100μmol/L)的白藜蘆醇仍然能夠有效對抗MG132的細(xì)胞毒性。AnnexinV/PI雙染證實MG132能夠明顯誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡,100μmol/L白藜蘆醇單獨處理K562細(xì)胞24h僅誘導(dǎo)了12%的細(xì)胞凋亡;聯(lián)合白藜蘆醇能夠明顯對抗MG132誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Western

6、Blot顯示,聯(lián)合白藜蘆醇能夠明顯的抑制由MG132誘導(dǎo)的PARP剪切成89kDa片段。
　　 二、白藜蘆醇能夠降低蛋白酶體抑制劑對白血病細(xì)胞的毒性效應(yīng)
　　 流式AnnexinV/PI雙染結(jié)果顯示,白藜蘆醇同樣能夠?qū)筂G132對NB4,U937,Daudi和Raji細(xì)胞凋亡作用,三種不同結(jié)構(gòu)的蛋白酶體抑制劑(PSI,lactacystin,epoxomicin)能夠誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡40-60%;同時5μmol/L

7、白藜蘆醇對三種不同結(jié)構(gòu)的蛋白酶體抑制劑都有明顯的對抗作用。
　　 三、白藜蘆醇對抗MG132誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性效應(yīng)過程中涉及到p27Kipl介導(dǎo)的G1/S阻滯
　　 使用5μmol/L白藜蘆醇、5μmol/LMG132分別處理K562,NB4,U937,Daudi和Raji細(xì)胞24h后,流式PI單染結(jié)果顯示前者S期細(xì)胞數(shù)增加,后者S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)均增加。與MG132單獨作用相比,聯(lián)合白藜蘆醇之后S期細(xì)胞數(shù)降低,而G1期

8、細(xì)胞數(shù)增加。Westernblot顯示,與對照組相比,白藜蘆醇、MG132單獨作用于K562細(xì)胞,均增加了p27Kipl的表達(dá),二者聯(lián)合使用時更多地增加了p27Kipl的表達(dá)。與對照組相比,敲低p27Kipl后微弱地對抗了MG132單獨誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,重要的是,在p27Kipl敲低細(xì)胞中白藜蘆醇對MG132作用的拮抗明顯削弱。四、白藜蘆醇和MG132通過FOXO1誘導(dǎo)p27Kipl上調(diào)
　　 實時定量PCR顯示,單獨使用白藜蘆醇

9、促進(jìn)mRNA水平p27Kipl表達(dá)增加,而MG132對其無明顯作用。兩者聯(lián)合使用,更能顯著地增加mRNA水平p27Kipl的表達(dá)。首先用RNA合成的抑制荊放線菌酮D預(yù)處理細(xì)胞,然后使用白藜蘆醇單獨或聯(lián)合MG132,結(jié)果顯示放線菌酮D在兩種處理方式中完全阻滯了p27KiplmRNAT水平的上調(diào)。實時定量PCR和Westernblot結(jié)果顯示,與vehicle或MG132處理組相比,白藜蘆醇單獨或聯(lián)合MG132處理組都能明顯增加FOXO1的

10、表達(dá)。ChIP實驗發(fā)現(xiàn)與單獨使用白藜蘆醇相比,白藜蘆醇聯(lián)合MG132處理后結(jié)合到p27Kipl啟動子的FOXO1明顯增多。采用siRNA敲低FOXO1后,Westernblot結(jié)果顯示明顯抑制了白藜蘆醇誘導(dǎo)的FOXO1表達(dá)。重要的是,由白藜蘆醇誘導(dǎo)的p27Kipl的表達(dá)也明顯被抑制。
　　 結(jié)論：
　　 1、白藜蘆醇可能通過調(diào)節(jié)FOXO1的轉(zhuǎn)錄活性和p27Kipl的募集從而對抗蛋白酶體抑制劑的細(xì)胞毒性效應(yīng)。