炎癥因素對心房纖顫發(fā)病的預測作用及其與心房纖顫高凝狀態(tài)和心肌重構的關系.pdf

1、研究目的： 心房纖顫（房顫）是一種最常見的心律失常，由于其可以造成心排量減少、心室率過快過慢，可加重心肌缺血及惡化心功能，并且可引起左房血栓形成和全身栓塞并發(fā)癥（其中腦栓塞形成發(fā)病率高），極大地威脅人民健康，造成了巨大的社會經(jīng)濟負擔。 本研究的主要目的包括：中國人TNF-α啟動子區(qū)SNPs位點基因型的分布特點，研究房顫發(fā)病是否伴發(fā)明顯的炎癥標記物的變化，研究決定炎癥上游因子TNF-α表達效率的基因啟動子區(qū)各SNP位點不同

2、基因型在房顫患者與非房顫對照個體分布情況是否不同，研究房顫發(fā)病的預測因子、尤其是不同基因型是否預示房顫發(fā)病風險高低；研究房顫本身是否伴發(fā)高凝狀態(tài)和血小板激活，研究高凝狀態(tài)和血小板激活可能的影響因素，尤其是炎癥因素在這個過程起何種作用；研究特發(fā)性房顫和孤立性房顫內(nèi)皮功能、凝血功能和血小板功能的變化特點及對抗栓治療方案的指導；研究房顫患者本身引起的心臟、特別使雙心房形態(tài)學改變及其與炎癥因素的相互關系。 研究方法： 入選房顫患

3、者102例（作為研究組）和性別、年齡和危險因素匹配的對照組個體117例。房顫通過心電圖或入院診斷進行確認。排除標準包括：高齡，合并明顯動脈硬化性疾病，先心病、風心病、心肌病、左室肥厚和心功能不全、等器質(zhì)性心臟病，糖尿病，慢性炎癥性疾病，結(jié)締組織疾病，60天內(nèi)手術史和急危重癥，腫瘤和重要器官功能衰竭。 詳細記錄患者病史（尤其是房顫發(fā)病時間和特點）、體檢情況（重點進行血壓測定、心臟體檢（包括心率、節(jié)律和脈率等各項和身高、體重、腹圍等

4、）、臨床檢驗（常規(guī)化驗、血生化指標、血凝血指標和炎癥指標等）和臨床檢查結(jié)果（常規(guī)胸片、心電圖和心臟超聲等檢查結(jié)果）。血脂、血糖、血肝腎功能等指標采用酶法測定，血纖維蛋白原（Fib）、部分凝血活酶時間、凝血酶原時間和凝血時間等采用酶法測定，血電解質(zhì)測定采用電解質(zhì)分析儀直接電極法、血CRP測定采用免疫濁度法、甲狀腺功能測定采用放射免疫法。心臟超聲檢查常規(guī)測量包含以下指標：左房前后徑（LAd）、右房上下徑（RAd）、室間隔收縮期厚度（IVSd

5、）、二尖瓣返流程度（MR）和左室射血分數(shù)（LVEF）?；颊呓M進行射頻消融治療者在術前72小時進行經(jīng)食道心臟超聲檢查。 留取研究對象的全血和血清標本，部分標本用于臨床送檢，全血標本用于基因組DNA提取，血清冷凍于-70℃低溫冰箱整批用于TNF-α、P-Selectin和vWF等細胞因子的檢測。 全血基因組DNA提取采用德國QIAGEN全血DNA小量提取試劑盒（QIAamp（）DNA Blood Mini Kits）提取，主

6、要步驟包括細胞裂解、過柱吸附、雜質(zhì)洗滌和DNA洗脫。采用瓊脂糖凝膠電泳方法確定DNA質(zhì)量，并采用光密度比對法確定其濃度。 使用Prime Premier5軟件設計TNF-α啟動子區(qū)目的片段引物，并交公司進行合成。采用PCR方法（美國Promega PCR擴增試劑盒GoTaq（）PCR Core SystemsⅠ）擴增基因組DNA的TNF-α啟動子區(qū)目的片段，主要步驟包括變性、退火和延伸，并反復進行多個循環(huán)。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝

7、膠電泳并與DNA marker進行比對，確認片段長度約為808bp。產(chǎn)物送公司進行專業(yè)純化和核酸測序。測序結(jié)果使用Chromas軟件進行讀圖，使用Pubmed網(wǎng)站Blast功能進行比對，確定每個個體基因型，尤其是各SNP位點的基因型。 血清細胞因子檢測采用免疫酶聯(lián)吸附分析方法（ELISA）檢測，其中血清TNF-α檢測采用美國R&D公司TNF-αELISA檢測試劑盒（Human TNF-α/TNFSF1AImmunoassay K

8、it），可溶性P-選擇素（sP-Selectin）檢測采用武漢博士德公司P-Selectin檢測試劑盒（Human P-Selectin ELISA Kit），血管病性假血友病因子（vWF）檢測采用上海太陽生物技術有限公司血管性血友病因子（vWF）含量測定試劑盒。主要步驟包括：結(jié)合抗原（樣本）、結(jié)合酶標抗體、洗滌、加底物顯色、終止反應并在酶標儀上進行光密度讀數(shù)。使用軟件Curve Expert1.3對各指標進行標準曲線制作和標本光密度讀

9、數(shù)-濃度轉(zhuǎn)換。 統(tǒng)計學分析采用SPSS13.0軟件進行，計量資料行正態(tài)性檢驗，正態(tài)性檢驗采用單樣本K-S擬和優(yōu)度檢驗（1-Sample K-S Test）。如符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)用x±S表示；如不符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)用中位數(shù)（median）（四分位數(shù)間距，IQR）表示。對于顯著偏態(tài)分布的資料，進行對數(shù)轉(zhuǎn)換后再進入?yún)f(xié)方差和回歸分析。 兩組正態(tài)分布的計量資料均數(shù)比較采用Student t檢驗，兩組中有一組以上是非正態(tài)分布的計量資

10、料均數(shù)比較采用Mann-Whitney U檢驗。兩組計量資料均數(shù)比較同時要控制其他對應變量有影響的因素時采用協(xié)方差分析，將可能有影響的因素作為協(xié)變量。計數(shù)資料表示為率，兩個率的比較采用卡方檢驗（Fisher's Exact Test）。兩組正態(tài)分布資料相關分析采用Pearson相關；對于非雙變量正態(tài)分布資料的相關分析，采用Spearman相關。兩變量相關分析同時控制其他因素對這種相關關系的影響時采用偏相關分析，將其他因素作為控制變量。

11、 房顫獨立預測因子估計采用logistic回歸分析，房顫分組作為應變量，其他房顫組與對照組比較差異顯著性P<0.20的變量以及性別、年齡等一般情況納入作為自變量。-308G/A不同基因型房顫風險推測采用卡方檢驗的“risk estimate”。重要的研究指標（包括炎癥促凝指標Fibrinogen和sP-Selectin）的影響因素估計采用多元回歸分析，將這些指標分別作為應變量，將性別、年齡、分組及單因素相關分析中分別與這些應變量相

12、關關系顯著性P<0.20的計量變量和不同分組應變量指標差異顯著性P<0.20的分類變量作為自變量。 研究結(jié)果： TNF-α啟動子區(qū)檢測片段內(nèi)-851、-575、-419和-244四個SNP位點未檢測到少見基因型（或少見堿基）。 房顫組和對照組的各項血液指標相比顯示房顫組和對照組血TNF-α（pg/ml）的濃度分別為3.84（3.07，4.49）和2.85（2.28，3.60），相比有顯著性差異（P<0.001）；

13、 陣發(fā)性房顫患者和對照組血Fib水平分別為3.20±0.84和2.77±0.60 g/L（P=0.005），陣發(fā)性房顫患者和對照組血血sP-selectin水平分別為26.2±5.9和21.5±3.9 ng/mL（P<0.001）。協(xié)方差仍然提示陣發(fā)性房顫Fib和sP-selectin水平分別較對照組顯著增高。 房顫組和對照組心動過緩發(fā)生率分別為29.7%和6.8%，相比有顯著性差異（P<0.001）。 -308

14、GG與-308non-GG個體血TNF-α濃度分別為3.37（2.72，4.44）和3.36（2.83，4.16），兩者相比無顯著性差異（P=0.600）。 Logistic回歸分析顯示，TNF-α、sP-selectin和LAd均是房顫的獨立預測因子，其OR值分別為1.375（95%CI：1.024-1.846，P=0.035）、1.248（95%CI：1.121-1.389，P<0.001）和1.321（95%CI：1.1

15、25-1.552，P=0.001）。 炎癥因素（TNF-α或CRP）與促凝血因素（sP-Selectin或Fib）之間均有顯著的正相關關系，尤其是CRP與Fib之間的相關系數(shù)為0.560（P<0.001）。 多元回歸分析表明，分組因素（是否房顫）標準回歸系數(shù)為0.446（P<0.001），顯示對血清sP-Selectin水平有顯著性影響。 研究結(jié)論： 1.本研究未發(fā)現(xiàn)研究人群在-851、-575

16、、-419和-244四個SNPs位點出現(xiàn)少見堿基。 2.首次發(fā)現(xiàn)房顫患者在TNF-α啟動子區(qū)-308位點少見基因型攜帶率顯著增高，并首次證實-308A攜帶者預示患房顫風險更高，提示TNF-α基因多態(tài)性影響房顫的易患性，支持炎癥因素作為房顫發(fā)病的病因之一。 3.發(fā)現(xiàn)炎癥標記物TNF-α、血小板功能標記物sP-selectin和左房大小標志LAd為房顫發(fā)生的獨立預測因子，支持炎癥因素在房顫的發(fā)病過程起作用。 4.證實

17、房顫時存在凝血功能激活。血Fib水平的顯著影響因素包括房顫發(fā)生率、性別、年齡和炎癥因素。房顫、女性、高齡和高炎癥水平提示高血Fib水平。首次發(fā)現(xiàn)炎癥因素對房顫患者凝血指標有顯著性影響。 5.證實房顫時存在血小板功能激活，未發(fā)現(xiàn)炎癥因素對其有顯著性影響。 6.證實陣發(fā)性房顫發(fā)作間歇期有明顯的高凝狀態(tài)和血小板激活。 7.特發(fā)性房顫患者凝血功能和血小板功能激活，孤立性房顫患者凝血功能無明顯激活，但血小板功能顯著激活。提