炎癥因素對心房纖顫發(fā)病的預(yù)測作用及其與心房纖顫高凝狀態(tài)和心肌重構(gòu)的關(guān)系.pdf

1、研究目的： 心房纖顫（房顫）是一種最常見的心律失常，由于其可以造成心排量減少、心室率過快過慢，可加重心肌缺血及惡化心功能，并且可引起左房血栓形成和全身栓塞并發(fā)癥（其中腦栓塞形成發(fā)病率高），極大地威脅人民健康，造成了巨大的社會經(jīng)濟負擔。 本研究的主要目的包括：中國人TNF-α啟動子區(qū)SNPs位點基因型的分布特點，研究房顫發(fā)病是否伴發(fā)明顯的炎癥標記物的變化，研究決定炎癥上游因子TNF-α表達效率的基因啟動子區(qū)各SNP位點不同

2、基因型在房顫患者與非房顫對照個體分布情況是否不同，研究房顫發(fā)病的預(yù)測因子、尤其是不同基因型是否預(yù)示房顫發(fā)病風險高低；研究房顫本身是否伴發(fā)高凝狀態(tài)和血小板激活，研究高凝狀態(tài)和血小板激活可能的影響因素，尤其是炎癥因素在這個過程起何種作用；研究特發(fā)性房顫和孤立性房顫內(nèi)皮功能、凝血功能和血小板功能的變化特點及對抗栓治療方案的指導(dǎo)；研究房顫患者本身引起的心臟、特別使雙心房形態(tài)學改變及其與炎癥因素的相互關(guān)系。 研究方法： 入選房顫患

3、者102例（作為研究組）和性別、年齡和危險因素匹配的對照組個體117例。房顫通過心電圖或入院診斷進行確認。排除標準包括：高齡，合并明顯動脈硬化性疾病，先心病、風心病、心肌病、左室肥厚和心功能不全、等器質(zhì)性心臟病，糖尿病，慢性炎癥性疾病，結(jié)締組織疾病，60天內(nèi)手術(shù)史和急危重癥，腫瘤和重要器官功能衰竭。 詳細記錄患者病史（尤其是房顫發(fā)病時間和特點）、體檢情況（重點進行血壓測定、心臟體檢（包括心率、節(jié)律和脈率等各項和身高、體重、腹圍等

4、）、臨床檢驗（常規(guī)化驗、血生化指標、血凝血指標和炎癥指標等）和臨床檢查結(jié)果（常規(guī)胸片、心電圖和心臟超聲等檢查結(jié)果）。血脂、血糖、血肝腎功能等指標采用酶法測定，血纖維蛋白原（Fib）、部分凝血活酶時間、凝血酶原時間和凝血時間等采用酶法測定，血電解質(zhì)測定采用電解質(zhì)分析儀直接電極法、血CRP測定采用免疫濁度法、甲狀腺功能測定采用放射免疫法。心臟超聲檢查常規(guī)測量包含以下指標：左房前后徑（LAd）、右房上下徑（RAd）、室間隔收縮期厚度（IVSd

5、）、二尖瓣返流程度（MR）和左室射血分數(shù)（LVEF）?；颊呓M進行射頻消融治療者在術(shù)前72小時進行經(jīng)食道心臟超聲檢查。 留取研究對象的全血和血清標本，部分標本用于臨床送檢，全血標本用于基因組DNA提取，血清冷凍于-70℃低溫冰箱整批用于TNF-α、P-Selectin和vWF等細胞因子的檢測。 全血基因組DNA提取采用德國QIAGEN全血DNA小量提取試劑盒（QIAamp（）DNA Blood Mini Kits）提取，主

6、要步驟包括細胞裂解、過柱吸附、雜質(zhì)洗滌和DNA洗脫。采用瓊脂糖凝膠電泳方法確定DNA質(zhì)量，并采用光密度比對法確定其濃度。 使用Prime Premier5軟件設(shè)計TNF-α啟動子區(qū)目的片段引物，并交公司進行合成。采用PCR方法（美國Promega PCR擴增試劑盒GoTaq（）PCR Core SystemsⅠ）擴增基因組DNA的TNF-α啟動子區(qū)目的片段，主要步驟包括變性、退火和延伸，并反復(fù)進行多個循環(huán)。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝

7、膠電泳并與DNA marker進行比對，確認片段長度約為808bp。產(chǎn)物送公司進行專業(yè)純化和核酸測序。測序結(jié)果使用Chromas軟件進行讀圖，使用Pubmed網(wǎng)站Blast功能進行比對，確定每個個體基因型，尤其是各SNP位點的基因型。 血清細胞因子檢測采用免疫酶聯(lián)吸附分析方法（ELISA）檢測，其中血清TNF-α檢測采用美國R&D公司TNF-αELISA檢測試劑盒（Human TNF-α/TNFSF1AImmunoassay K

8、it），可溶性P-選擇素（sP-Selectin）檢測采用武漢博士德公司P-Selectin檢測試劑盒（Human P-Selectin ELISA Kit），血管病性假血友病因子（vWF）檢測采用上海太陽生物技術(shù)有限公司血管性血友病因子（vWF）含量測定試劑盒。主要步驟包括：結(jié)合抗原（樣本）、結(jié)合酶標抗體、洗滌、加底物顯色、終止反應(yīng)并在酶標儀上進行光密度讀數(shù)。使用軟件Curve Expert1.3對各指標進行標準曲線制作和標本光密度讀

9、數(shù)-濃度轉(zhuǎn)換。 統(tǒng)計學分析采用SPSS13.0軟件進行，計量資料行正態(tài)性檢驗，正態(tài)性檢驗采用單樣本K-S擬和優(yōu)度檢驗（1-Sample K-S Test）。如符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)用x±S表示；如不符合正態(tài)分布，數(shù)據(jù)用中位數(shù)（median）（四分位數(shù)間距，IQR）表示。對于顯著偏態(tài)分布的資料，進行對數(shù)轉(zhuǎn)換后再進入?yún)f(xié)方差和回歸分析。 兩組正態(tài)分布的計量資料均數(shù)比較采用Student t檢驗，兩組中有一組以上是非正態(tài)分布的計量資

10、料均數(shù)比較采用Mann-Whitney U檢驗。兩組計量資料均數(shù)比較同時要控制其他對應(yīng)變量有影響的因素時采用協(xié)方差分析，將可能有影響的因素作為協(xié)變量。計數(shù)資料表示為率，兩個率的比較采用卡方檢驗（Fisher's Exact Test）。兩組正態(tài)分布資料相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)；對于非雙變量正態(tài)分布資料的相關(guān)分析，采用Spearman相關(guān)。兩變量相關(guān)分析同時控制其他因素對這種相關(guān)關(guān)系的影響時采用偏相關(guān)分析，將其他因素作為控制變量。

11、 房顫獨立預(yù)測因子估計采用logistic回歸分析，房顫分組作為應(yīng)變量，其他房顫組與對照組比較差異顯著性P<0.20的變量以及性別、年齡等一般情況納入作為自變量。-308G/A不同基因型房顫風險推測采用卡方檢驗的“risk estimate”。重要的研究指標（包括炎癥促凝指標Fibrinogen和sP-Selectin）的影響因素估計采用多元回歸分析，將這些指標分別作為應(yīng)變量，將性別、年齡、分組及單因素相關(guān)分析中分別與這些應(yīng)變量相

12、關(guān)關(guān)系顯著性P<0.20的計量變量和不同分組應(yīng)變量指標差異顯著性P<0.20的分類變量作為自變量。 研究結(jié)果： TNF-α啟動子區(qū)檢測片段內(nèi)-851、-575、-419和-244四個SNP位點未檢測到少見基因型（或少見堿基）。 房顫組和對照組的各項血液指標相比顯示房顫組和對照組血TNF-α（pg/ml）的濃度分別為3.84（3.07，4.49）和2.85（2.28，3.60），相比有顯著性差異（P<0.001）；

13、 陣發(fā)性房顫患者和對照組血Fib水平分別為3.20±0.84和2.77±0.60 g/L（P=0.005），陣發(fā)性房顫患者和對照組血血sP-selectin水平分別為26.2±5.9和21.5±3.9 ng/mL（P<0.001）。協(xié)方差仍然提示陣發(fā)性房顫Fib和sP-selectin水平分別較對照組顯著增高。 房顫組和對照組心動過緩發(fā)生率分別為29.7%和6.8%，相比有顯著性差異（P<0.001）。 -308

14、GG與-308non-GG個體血TNF-α濃度分別為3.37（2.72，4.44）和3.36（2.83，4.16），兩者相比無顯著性差異（P=0.600）。 Logistic回歸分析顯示，TNF-α、sP-selectin和LAd均是房顫的獨立預(yù)測因子，其OR值分別為1.375（95%CI：1.024-1.846，P=0.035）、1.248（95%CI：1.121-1.389，P<0.001）和1.321（95%CI：1.1

15、25-1.552，P=0.001）。 炎癥因素（TNF-α或CRP）與促凝血因素（sP-Selectin或Fib）之間均有顯著的正相關(guān)關(guān)系，尤其是CRP與Fib之間的相關(guān)系數(shù)為0.560（P<0.001）。 多元回歸分析表明，分組因素（是否房顫）標準回歸系數(shù)為0.446（P<0.001），顯示對血清sP-Selectin水平有顯著性影響。 研究結(jié)論： 1.本研究未發(fā)現(xiàn)研究人群在-851、-575

16、、-419和-244四個SNPs位點出現(xiàn)少見堿基。 2.首次發(fā)現(xiàn)房顫患者在TNF-α啟動子區(qū)-308位點少見基因型攜帶率顯著增高，并首次證實-308A攜帶者預(yù)示患房顫風險更高，提示TNF-α基因多態(tài)性影響房顫的易患性，支持炎癥因素作為房顫發(fā)病的病因之一。 3.發(fā)現(xiàn)炎癥標記物TNF-α、血小板功能標記物sP-selectin和左房大小標志LAd為房顫發(fā)生的獨立預(yù)測因子，支持炎癥因素在房顫的發(fā)病過程起作用。 4.證實

17、房顫時存在凝血功能激活。血Fib水平的顯著影響因素包括房顫發(fā)生率、性別、年齡和炎癥因素。房顫、女性、高齡和高炎癥水平提示高血Fib水平。首次發(fā)現(xiàn)炎癥因素對房顫患者凝血指標有顯著性影響。 5.證實房顫時存在血小板功能激活，未發(fā)現(xiàn)炎癥因素對其有顯著性影響。 6.證實陣發(fā)性房顫發(fā)作間歇期有明顯的高凝狀態(tài)和血小板激活。 7.特發(fā)性房顫患者凝血功能和血小板功能激活，孤立性房顫患者凝血功能無明顯激活，但血小板功能顯著激活。提