OECs較星型膠質細胞對NSCs分化作用的比較研究.pdf

1、目的:
　　建立體外純化培養(yǎng)嗅鞘細胞(Olfactory ensheathing cells, OECs)的穩(wěn)定方法并觀察培養(yǎng)的嗅鞘細胞形態(tài)學特征;比較大鼠嗅鞘細胞與星型膠質細胞在體外對神經干細胞(Neural stem cells,NSCs)分化的影響。
　　方法:
　　分別從新生SD大鼠的嗅球采用小劑量阿糖胞苷分次純化法分離、培養(yǎng)嗅鞘細胞;從海馬、大腦皮質分離、培養(yǎng)星型膠質細胞、神經干細胞,觀察細胞的形態(tài)發(fā)育特點及

2、免疫組化特性。收集嗅鞘細胞及其上清液、星型膠質細胞及其上清液,將實驗分為5組:組Ⅰ:OECs上清液+NSCs;組Ⅱ: OECs+NSCs;組Ⅲ:星型膠質細胞上清液+ NSCs;組Ⅳ:星型膠質細胞+ NSCs;組Ⅴ:NSCs單獨培養(yǎng)作為對照;將NSCs克隆球平均分成5份,加入各組,不加b-FGF、EFGF、B27,組Ⅰ和組Ⅲ分別用培養(yǎng)了OECs、星形膠質細胞24h的DMEM/F12(1:1)上清液3ml培養(yǎng),每24h換液,組Ⅱ和組Ⅳ、組Ⅴ

3、用 DMEM/F12(1:1)3ml培養(yǎng),每24h換液,各組置于相同條件培養(yǎng)箱培養(yǎng),倒置顯微鏡下動態(tài)觀察各組NSCs被誘導分化的細胞的生長情況,并采用免疫組化法對分化細胞鑒定和計數。
　　結果:
　　1、原代培養(yǎng)后24小時OECs形態(tài)基本可辨,背景可見成纖維細胞,第2天開始予小劑量阿糖胞苷分次純化后成纖維細胞大大減少,OECs的外形主要以突起細長的雙極和三極為主,或無突起呈“煎蛋樣”,隨時間延長細胞生長排列呈現一定方向性;細

4、胞免疫化學示大部分細胞神經生長因子受體 P75(neurotrophin receptor p75,NGFRp75)陽性表達。
　　2、比較大鼠嗅鞘細胞與星型膠質細胞在體外對 NSCs分化的影響結果發(fā)現:組Ⅰ、組Ⅱ的NSCs球6h已開始貼壁生長,至第7天,多數分化為具有2-3個長突起,胞體圓形或橢圓形的神經元樣細胞, NF200(1:150)免疫組織化學結果顯示這類細胞胞體甚至突觸皆被染成棕黃色,胞核不染色,為強陽性,證明該類細胞

5、為神經元,計算其神經元分化率:組Ⅰ為(51.43±8.58)％,組Ⅱ為(50.11±9.56)%;組Ⅲ、組Ⅳ大部分細胞 NF200(1:150)染色陰性,GFAP(1:150)陽性,其神經元分化率分別為(17.25±3.01)%、(15.51±1.62)%;組Ⅴ的NSCs球大多數在3-4天后萎縮、漂浮,5-7天基本死亡,神經元分化率為(0.56±0.33)%。經統(tǒng)計學分析嗅鞘細胞組的神經元分化率遠遠高于星型膠質細胞組及對照組的神經元分化