HBx蛋白調(diào)節(jié)大鼠肝干細(xì)胞分化作用的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，我國發(fā)病約占全世界發(fā)病的45％左右，而且預(yù)后不良，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。近年來，隨著診斷、治療技術(shù)的進(jìn)步，多種手段的綜合治療措施已經(jīng)較大地改善了肝癌患者的生存質(zhì)量，但其治愈率及生存率依然不能令人滿意，肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是影響患者生存期的重要因素。細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)的巨大進(jìn)步為研究和探討肝癌的起源、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移提供了重要的手段，目前，

2、我們已能夠從基因水平、蛋白水平直至細(xì)胞水平等各個層次和角度來認(rèn)識肝癌的起源、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，為臨床治療肝癌提供了重要的理論基礎(chǔ)，盡管如此，我們依然缺乏對肝癌各種生物學(xué)行為更加系統(tǒng)的認(rèn)識以及為指導(dǎo)臨床治療肝癌提供更加具有針對性和有效的治療措施。因此，研究原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展規(guī)律以指導(dǎo)診斷治療一直是科研工作者們孜孜以求的目標(biāo)。
　　現(xiàn)在認(rèn)為，原發(fā)性肝癌的發(fā)生與一些存在肝硬化的慢性肝病密切相關(guān)，是一個多因素、多階段、多基因共同的積累過程。關(guān)

3、于細(xì)胞癌變存在兩種假說：（1）癌變是由已分化成熟的細(xì)胞去分化（退化）而引起；（2）癌變是干細(xì)胞在分化過程中受阻滯（異常分化）而引起。
　　乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)的慢性感染與HCC之間存在著密切的聯(lián)系，然而HBV誘發(fā)HCC的確切機(jī)制仍不十分清楚。有研究表明，乙肝病毒X基因及其編碼的X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)在HCC的發(fā)生中起著重要的作用。為進(jìn)一步探討HBV

4、X基因在與HBV相關(guān)HCC發(fā)生中的作用，我們將在我科已經(jīng)成功分離、純化、培養(yǎng)大鼠肝干細(xì)胞的基礎(chǔ)上，從HBV這一導(dǎo)致HCC發(fā)生的重要危險因素入手，以病毒HBVX基因以及其產(chǎn)物HBx蛋白作為對象，通過轉(zhuǎn)染HBVX基因到大鼠肝干細(xì)胞，分析在肝干細(xì)胞分化過程中，HBx蛋白對其的影響，觀察表達(dá)蛋白及細(xì)胞表面分子變化，進(jìn)一步了解肝干細(xì)胞分化受阻的機(jī)理。
　　為此，我們構(gòu)建了帶有綠色熒光蛋白的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至大鼠肝干細(xì)胞中，通過細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞分

5、泌蛋白等變化，觀察轉(zhuǎn)染后的大鼠肝干細(xì)胞的生長情況；在裸鼠皮下注射轉(zhuǎn)染HBVX基因的、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒及正常大鼠肝干細(xì)胞，觀察成瘤率及腫瘤的生長情況，探討在體內(nèi)實(shí)驗中HBVX基因在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。
　　我們首先成功的構(gòu)建了質(zhì)粒，為帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報告基因HBVX基因的質(zhì)粒PIRES2-EGFP-HBx。將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大鼠肝干細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)攜帶HBx的大鼠肝干細(xì)胞盡管生長速度和大鼠肝干細(xì)胞無明顯差異，但在分化過程中產(chǎn)

6、生的分化細(xì)胞合成白蛋白、尿素氮的能力下降，大量表達(dá)甲胎蛋白，逐步遠(yuǎn)離肝細(xì)胞特征。
　　轉(zhuǎn)染HBVX基因、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒及正常大鼠肝干細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力變化的實(shí)驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染HBVX基因組的裸鼠局部形成腫瘤，說明攜帶HBVX基因，表達(dá)HBx蛋白的大鼠肝干細(xì)胞在分化過程中，致瘤能力增強(qiáng)。
　　以上結(jié)果提示轉(zhuǎn)染HBVX基因的大鼠肝干細(xì)胞在分化過程中，受到HBVX基因的調(diào)控，不能向肝細(xì)胞或者膽管上皮細(xì)胞分化，而是增加惡性致瘤能力，