1,25(OH)2D3促進(jìn)NSCs向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化及對(duì)分化細(xì)胞保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分1,25(OH)2D3對(duì)促進(jìn)NSCs增殖和向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：（1）建立新生SD大鼠神經(jīng)干細(xì)胞系，探討不同濃度的1,25(OH)2D3對(duì)NSCs增殖的影響；（2）探討1,25(OH)2D3對(duì)NSCs向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的促進(jìn)作用及最佳濃度。方法：（1）取新生SD大鼠大腦皮層，用無血清培養(yǎng)技術(shù)連續(xù)傳代4次后行熒光鑒定，取第5代的NSCs處理成單細(xì)胞懸液，加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為5.

2、03105/ml后分成7個(gè)實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)移到24孔板上，每組6個(gè)孔，每孔500微升。A組：正常對(duì)照組（Normal control），僅含 DMEM/F12完全培養(yǎng)基；B組：溶媒對(duì)照組（ Vehicle control），含0.1％無水乙醇的DMEM/F12完全培養(yǎng)基；C組：溶媒對(duì)照組（Vehicle control），含1%無水乙醇的DMEM/F12完全培養(yǎng)基；D、E、F、G組：依次為含濃度10-8、10-7、10-6和10-5mol/l

3、1,25(OH)2D3的DMEM/F12完全培養(yǎng)基。各組均在常規(guī)條件下培養(yǎng)七天，七天后將24孔板內(nèi)的細(xì)胞球在光學(xué)顯微鏡下觀察后按分組經(jīng)離心、機(jī)械吹打?qū)⑸窠?jīng)干細(xì)胞處理成單細(xì)胞懸液并更換完全培養(yǎng)基，每孔取一滴行臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)并統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組細(xì)胞增殖情況，然后加入抗小鼠BrdU單抗（工作濃度1：50）行BrdU標(biāo)記，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞率，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組標(biāo)記細(xì)胞數(shù)。（2）取第5代的NSCs處理成單細(xì)胞懸液，加入DMEM/HIGH GLUCOS

4、E基礎(chǔ)培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為5.03105/ml后轉(zhuǎn)移到6孔板上，分成6個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組6個(gè)孔，每孔2毫升。A組：胎牛血清對(duì)照組（Normal control），含10%胎牛血清的DMEM/HIGH GLUCOSE基礎(chǔ)培養(yǎng)基；B組：溶媒對(duì)照組（Vehicle control），含0.1%無水乙醇及10%胎牛血清的DMEM/HIGH GLUCOSE基礎(chǔ)培養(yǎng)基；C、D、E組：依次為含濃度10-8、10-7和10-6mol/l1,25(OH)2

5、D3的DMEM/HIGH GLUCOSE基礎(chǔ)培養(yǎng)基。以上各組均在相同適宜的條件下誘導(dǎo)分化7天。7天后分別以一抗（兔抗大鼠Gal單克隆抗體，1:100）、二抗（山羊抗兔 IgG-FITC，1:100）染色處理并吹打重懸細(xì)胞分別轉(zhuǎn)入測(cè)試管，流式細(xì)胞儀收集細(xì)胞分析10000個(gè)細(xì)胞，以陽性細(xì)胞數(shù)表示少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，陰性細(xì)胞數(shù)表示其他細(xì)胞數(shù)量。確定陽性細(xì)胞比例最高組后，按該濃度1,25(OH)2D3設(shè)實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)設(shè)含10%胎牛血清的對(duì)照組，在6

6、孔板上培養(yǎng)，每組12個(gè)孔，每個(gè)孔2毫升DMEM/HIGH GLUCOSE基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按照上述方法培養(yǎng)7天。七天后將實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組各取3孔組成1個(gè)小組，共4組，依次用一抗(兔抗大鼠 Nestin IgG,1:100、兔抗大鼠 NF-200抗體,1:100、兔抗大鼠 GFAP多克隆抗體,1:125、兔抗大鼠 Gal單克隆抗體,1:100）標(biāo)記，然后用適宜濃度的二抗染色。將各組熒光染色的細(xì)胞，在倒置熒光顯微鏡下選取適宜激發(fā)的光線觀察并照相。然

7、后將孔板中的細(xì)胞經(jīng)酶消化、機(jī)械吹打法處理成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.03105/ml，按照上述流式細(xì)胞儀檢測(cè)的方法處理細(xì)胞后，將各組細(xì)胞行流式細(xì)胞儀分析，依次統(tǒng)計(jì)各組細(xì)胞的比例變化。結(jié)果：（1）臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，正常對(duì)照組、含0.1%無水乙醇溶媒對(duì)照組和10-8mol/l1,25(OH)2D3間未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），10-7和10-6濃度的1,25(OH)2D3能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖（P＜0.05），且10-6m

8、ol/l1,25(OH)2D3能使神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量增殖最多，神經(jīng)球體積更大、數(shù)量更多，但含1%無水乙醇的溶媒對(duì)照組和含10-5mol/l1,25(OH)2D3組細(xì)胞數(shù)量明顯下降，與正常對(duì)照比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。BrdU標(biāo)記結(jié)果同臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果類似。正常對(duì)照組、含0.1%無水乙醇溶媒對(duì)照組和10-8mol/l1,25(OH)2D3組間未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（ P＞0.05），10-6mol/l1,25(OH)2D3使神經(jīng)干細(xì)胞增殖率

9、最高。10-5mol/l1,25(OH)2D3組與含1%無水乙醇的溶媒對(duì)照組細(xì)胞增殖率均明顯下降，而兩組均含有1%無水乙醇，考慮細(xì)胞損害與無水乙醇含量過高有關(guān)，故在下述實(shí)驗(yàn)中將不再設(shè)置10-5mol/l的1,25(OH)2D3組。（2）1,25(OH)2D3促神經(jīng)干細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溶媒對(duì)照組和胎牛血清分化對(duì)照組間未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而給予10-8、10-7和10-6mol/l1,25(OH)2D3處理

10、后，分化出的少突膠質(zhì)細(xì)胞比例增加，與胎牛血清分化組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義（均 P＜0.05），且隨1,25(OH)2D3濃度的增加，1,25(OH)2D3促進(jìn)NSCs向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化效果更加明顯，1,25(OH)2D3濃度的達(dá)到10-6mol/l時(shí)使NSCs向少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化比例達(dá)到最大值。在1,25(OH)2D3濃度的達(dá)到10-6mol/l時(shí)，NSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化后各類型細(xì)胞的比例分別為：少突膠質(zhì)細(xì)胞30.48±2.31%、神經(jīng)元26

11、.33±1.97%、星形膠質(zhì)細(xì)胞30.58±2.03%、未分化的神經(jīng)干細(xì)胞12.61±1.09%。結(jié)論：（1）1,25(OH)2D3具有促進(jìn)NSCs增殖的作用，隨著濃度增加NSCs細(xì)胞增殖數(shù)量增加，且10-6mol/l1,25(OH)2D3能使神經(jīng)球數(shù)量增多、體積明顯增大，神經(jīng)干細(xì)胞增殖數(shù)量達(dá)到最大值。（2）1,25(OH)2D3具有促進(jìn)NSCs向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的生物學(xué)效應(yīng)，隨著濃度增加少突膠質(zhì)細(xì)胞分化比例增大，在10-6mol/l時(shí)

12、達(dá)到最大值，可使少突膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞的分化比例達(dá)到30.48±2.31%。
　　第二部分1,25(OH)2D3對(duì)缺血缺氧少突膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用
　　目的：構(gòu)建少突膠質(zhì)細(xì)胞體外缺血缺氧損傷模型，探討不同濃度的1,25(OH)2D3對(duì)缺血缺氧的少突膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用；方法：選用少突膠質(zhì)細(xì)胞分化比例最高組1,25(OH)2D3的濃度是10-6mol/l，在25cm2培養(yǎng)瓶里誘導(dǎo)分化少突膠質(zhì)細(xì)胞，獲取大量的細(xì)胞后，根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)到的

13、熒光散射度或者發(fā)光度差異來分離細(xì)胞。將流式細(xì)胞儀分離提純后的少突膠質(zhì)細(xì)胞加入無糖平衡鹽緩沖液調(diào)整到細(xì)胞濃度53105個(gè)/ml，分成7個(gè)實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)移到24孔板上每組6個(gè)孔，每孔500微升。A組：正常對(duì)照組（Normal control），僅含 DMEM/HIGH GLUCOSE完全培養(yǎng)基；B、C、D、E組：依次為含濃度10-9、10-8、10-7和10-6mol/l1,25(OH)2D3的無糖平衡鹽緩沖液；F組：缺血缺氧對(duì)照組，等量無糖的

14、平衡鹽緩沖液；G組，溶媒對(duì)照組：0.1%無水乙醇+無糖的平衡鹽緩沖液。其中缺血缺氧對(duì)照組、溶媒對(duì)照組和不同濃度的1,25(OH)2D3的實(shí)驗(yàn)組將采用糖氧剝奪（ oxygen glucose deprivation，OGD）法構(gòu)建少突膠質(zhì)細(xì)胞的體外缺血缺氧損傷的模型培養(yǎng)6個(gè)小時(shí)，正常對(duì)照組則是在適宜條件下培養(yǎng)6個(gè)小時(shí)。通過MTT比色法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)少突膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞活力以及損傷凋亡狀況。結(jié)果：同正常對(duì)照組比較，缺血缺氧對(duì)照組及溶媒對(duì)照組

15、的少突膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯增高（均 P＜0.05），但缺血缺氧對(duì)照組與溶媒對(duì)照組組間比較上述指標(biāo)無明顯差異（均P＞0.05）；而1,25(OH)2D3實(shí)驗(yàn)組同缺血缺氧對(duì)照組比較，隨著1,25(OH)2D3濃度升高少突膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞活力增強(qiáng)，凋亡率減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但10-7mol/l1,25(OH)2D3組和10-6mol/l1,25(OH)2D3組相較差異不明顯（P＞0.05）；在增強(qiáng)細(xì)胞活力方面，10-