1α,25-(OH)2D3調(diào)控破骨細(xì)胞分化的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、分類號UDCⅢIIllIIIllllIIIIIIIY3274161指導(dǎo)教師姓名：申請學(xué)位級別：論文提交日期：學(xué)位授予單位：學(xué)號密級埸H1大季YANGZHOUUNIVERSITY碩士學(xué)位論文(全目制學(xué)術(shù)學(xué)位)1僅，25一(OH)2D3調(diào)控破骨細(xì)胞分化的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究孔琦學(xué)科專業(yè)名稱：墮鏖?？锾谜撐拇疝q日期：2Q12生魚旦學(xué)位授予目期：2Q12生魚旦2017年6月三孔琦1cc，25(OH)2D3調(diào)控破骨細(xì)胞分化的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究I中又

2、手兩芰維生素D是一種脂溶性類固醇衍生物，在人體鈣、磷代謝及骨骼正常生理機(jī)能的維持中有著重要作用，1q，25一二羥維生素D3[1值，25dihydroxyvitaminD3，10l，25一(OH)2D3]是維生素D的主要活性形式。研究表明1Cc，25(OH)2D3對破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)的分化與功能有調(diào)控作用，但是具體機(jī)制尚不清楚。本研究以RAW2647細(xì)胞作為破骨細(xì)胞前體細(xì)胞(osteoclastprecursorcel

3、l，OPC)，添加25ng／mL巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophagecolonystimulatingfactor，MCSF)和30ng／mL核因子1①受體活化因子配體(receptoractivatorofnuclearfactorKBligand，RANKL)誘導(dǎo)其分化為OC，免疫熒光和蛋白質(zhì)免疫印跡(Westernblot)方法研究維生素D受體(vitaminDreceptor，VDR)在細(xì)胞內(nèi)的分布，實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析技術(shù)

4、(realtimecellularanalysis，RTCA)檢測RAW2647細(xì)胞增殖，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtimequantitativepolymerasechainreaction，qRTPCR)檢測OC標(biāo)志基因表達(dá)，利用雙向電泳(twodimensionalelectrophoresis，2DE)H質(zhì)譜鑒定技術(shù)建立了10【，25(OH)2D3調(diào)控OC分化的蛋白差異表達(dá)譜，并對差異蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定，主要結(jié)果如下：1RA

5、W2647細(xì)胞及OC均可表達(dá)VDR，細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中都有VDR存在，但是0、10一、10一、10。7mol／L10c，25(OH)2D3處理，RAW2647細(xì)胞增殖無顯著區(qū)別。10。8mol／L濃度10c，25(OH)2D3可極顯著促進(jìn)OC分化，處理5d時(shí)極顯著上調(diào)TRAP、CK、MMP9基因表達(dá)，而極顯著抑制CA仃基因表達(dá)。2對OC分化第1、3、5d10c，25(OH)aD3處理組與空白對照組的蛋白差異表達(dá)譜進(jìn)行分析，檢測到2

6、3個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，質(zhì)譜鑒定為22種蛋白質(zhì)，對其中19種蛋白質(zhì)進(jìn)行基因本體(GeneOntology，GO)和STRING分析。結(jié)果顯示，基于分子功能，差異蛋白質(zhì)可聚集到蛋白質(zhì)結(jié)合等12個(gè)GOterm；基于生物學(xué)過程，這些蛋白質(zhì)能夠聚集到負(fù)調(diào)節(jié)凋亡過程等14個(gè)GOterm；基于細(xì)胞組成，這些蛋白質(zhì)能夠聚集到14個(gè)GOterm上，在細(xì)胞內(nèi)外均有分布；STRING分析顯示大部分差異蛋白質(zhì)存在或可能存在相互關(guān)聯(lián)。根據(jù)結(jié)果推測，10【，25(O

7、H)2D3可能通過促進(jìn)能量代謝，細(xì)胞黏附，抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)OC生成。3應(yīng)用qRTPCR方法對丙酮酸激酶、核仁磷酸蛋白1、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3、巨噬細(xì)胞遷移抑制因子、半乳糖凝集素3、膜聯(lián)蛋白A2、SH3域結(jié)合谷氨酸富含樣蛋白3、延長因子10【1這8個(gè)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，除延長因子10【1基因表達(dá)沒有顯著變化外，第3d丙酮酸激酶和第5d蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3基因表達(dá)水平與2DE中蛋白表達(dá)變化一致，其余蛋白質(zhì)基因表達(dá)水平與蛋白表達(dá)