M-CSF、RANKL和1,25-(OH)2D3對破骨細胞形成分化影響的比較研究.pdf

1、目的：利用全骨髓細胞培養(yǎng)系，研究M-CSF、RANKL和1,25-(OH)2D3對體外誘導培養(yǎng)的破骨細胞形成及分化的影響，探討三種細胞因子間相互作用及協(xié)同作用，為進一步研究破骨細胞及合理選用細胞因子提供依據(jù)。
　　 方法：選用4周齡SD雄性大鼠（體重80-120g），利用全骨髓細胞培養(yǎng)系，進行體外破骨細胞誘導培養(yǎng)，觀察M-CSF、RANKL和1,25-(OH)2D3對破骨細胞形成及分化的影響，同時比較三種細胞因子的作用。

2、　　 1.細胞培養(yǎng)及細胞因子添加：
　　 1.1 全骨髓細胞培養(yǎng)：取4周齡SD雄性大鼠一只(80-120g)，異氟烷麻醉后，無菌條件下取其股骨和脛骨，剪掉骨垢端暴露骨髓腔，用10ml無菌注射器抽取不含胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，收集全骨髓細胞，將所提取的細胞懸液充分吹打至沒有細胞團塊后，置于離心機內(nèi)離心5分鐘（1500轉/分），棄去上清液，加入含15％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液，充分吹打混勻后形成單細胞懸液，用細胞計

3、數(shù)板計算細胞數(shù)，計算出細胞原液濃度，然后配制濃度為2×106cells/ml的細胞懸液，加入青霉素100單位/ml和鏈霉素100ug/ml。將細胞播種于24孔培養(yǎng)板（4行6列）中，每孔加入濃度為2×106cells/ml的細胞懸液0.5ml。
　　 1.2 細胞因子的添加：24孔培養(yǎng)板第一列為對照組，不添加任何藥物：第二列加入1,25-(OH)2D3(1×10-8Mol/ml);第三列加入1,25-(OH)2D3+RANKL(1

4、,25-(OH)2D31×10-8Mol/ml+RANKL20ng/ml）；第四列加入1,25-(OH)2D3+M-CSF(1，25-(OH)2D31×10-8Mol/ml+M-CSF20ng/ml);第五列加入1,25-(OH)2D3+M-CSF+RANKL(1,25-(OH)2D31×10-8Mol/ml+M-CSF20ng/ml+RANKL20ng/ml);第六列加入RANKL+M-CSF(RANKL20ng/ml+M-CSF20

5、ng/ml)。
　　 1.3 細胞培養(yǎng)：細胞因子添加完畢后將培養(yǎng)板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至第4天時更換培養(yǎng)液一次，共培養(yǎng)7天。
　　 2.抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色：培養(yǎng)至第7天后行TRAP染色，倒置光鏡下觀察，計算3核以上染色陽性細胞數(shù)。
　　 3.統(tǒng)計學分析：使用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)處理采用非參數(shù)檢驗的方差分析和S-N-K檢驗。
　　 結果：
　　

6、 1.破骨細胞的形態(tài)學特征培養(yǎng)前三天各組均未見破骨細胞形成，培養(yǎng)第五天開始實驗組可見少量破骨細胞形成，培養(yǎng)至第七天實驗組破骨細胞已經(jīng)分化成熟，而對照組始終沒有破骨細胞的形成。對全骨髓細胞培養(yǎng)進行TRAP染色后，光鏡下可見到大量成熟的破骨細胞，其形態(tài)學特征為：細胞體積較大，呈橢圓形、漏斗形、油煎蛋樣、條索狀或不規(guī)則形。細胞漿豐富呈紫紅色，細胞核較大，數(shù)目達幾個甚至多達幾十個，核仁清晰，細胞漿內(nèi)可見空泡結構。
　　 2.M-CSF、

7、RANKL和1,25-(OH)2D3對破骨細胞的形成和分化均具有促進作用，多因子比單因子和雙因子在相同條件下形成的破骨細胞數(shù)目多。全骨髓培養(yǎng)系中，培養(yǎng)板第一列（對照組）沒有添加細胞因子，最終沒有破骨細胞的形成；第二列加入1,25-(OH)2D3形成了破骨細胞，證明1,25-(OH)2D3對破骨細胞的形成和分化具有促進作用；第三列、第四列除加入1,25-(OH)2D3外，還分別加入了RANKL和M-CSF，最終都有破骨細胞的形成，并且形成

8、破骨細胞的數(shù)目較第二列多，與第二列相比統(tǒng)計學有顯著性差異(P＜0.05)，說明RANKL和M-CSF對破骨細胞的形成和分化也具有促進作用，但第三、四列間無顯著性差異(P＞0.05)；第五列同時加入M-CSF、RANKL和1,25-(OH)2D3后形成的破骨細胞數(shù)目最多，說明三種細胞因子對破骨細胞形成和分化具有協(xié)同促進作用，與第二、三、四、六列比較，有顯著性差異(P＜0.05)。第六列只加入RANKL和M-CSF后也形成了破骨細胞，但數(shù)量