1,25(OH)2D3對mTOR介導(dǎo)的早期糖尿病腎病的干預(yù)及保護(hù)作用的研究.pdf

1、第一部分1,25(OH)2D3抑制高糖介導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞的增殖作用的研究
　　目的：觀察高糖對大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖及肥大的影響；摸索高糖及1,25(OH)2D3對腎小球系膜細(xì)胞的最佳干預(yù)條件；觀察1,25(OH)2D3對高糖介導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響。
　　方法：體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞（HBZY-1），用不同濃度葡萄糖培養(yǎng)HBZY-1細(xì)胞：①正常葡萄糖濃度組（normal glucose,NG）:葡萄糖濃度為

2、5.5mmol/L培養(yǎng)基進(jìn)行 HBZY-1細(xì)胞培養(yǎng)；②高葡萄糖濃度組15（high glucose，HG15）：葡萄糖濃度為15mmol/L培養(yǎng)液進(jìn)行HBZY-1細(xì)胞培養(yǎng)；③高葡萄糖濃度組25（high glucose，HG25）：葡萄糖濃度為25mmol/L培養(yǎng)液進(jìn)行HBZY-1細(xì)胞培養(yǎng)；④高葡萄糖濃度組35（high glucose，HG35）：葡萄糖濃度為35mmol/L培養(yǎng)液進(jìn)行HBZY-1細(xì)胞培養(yǎng)。光鏡下觀察細(xì)胞直徑變化，臺(tái)盼

3、藍(lán)拒染法觀察細(xì)胞增殖情況，確定體外模擬糖尿病腎病的最佳葡萄糖干預(yù)濃度；MTT法檢測1,25(OH)2D3對高糖介導(dǎo)的 HBZY-1細(xì)胞增殖的抑制作用，確定1,25(OH)2D3干預(yù) HBZY-1細(xì)胞的最佳條件；Lenti-shVDR轉(zhuǎn)染入HBZY-1細(xì)胞，RT-PCR及western blot分別檢測包含4條干擾序列的Lenti-shVDR的mRNA及蛋白表達(dá)水平，篩選Lenti-shVDR的最佳干擾序列。細(xì)胞隨機(jī)分組為：①正常葡萄糖濃

4、度組（normal glucose,NG）:葡萄糖濃度為5.5mmol/L培養(yǎng)基進(jìn)行 HBZY-1細(xì)胞培養(yǎng)。②高葡萄糖濃度組（high glucose，HG）：用高濃度葡萄糖配制培養(yǎng)基，進(jìn)行HBZY-1細(xì)胞培養(yǎng)。③高葡萄糖濃度+1,25(OH)2D3干預(yù)組（HG+1,25(OH)2D3， HV）：在高糖培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，向培養(yǎng)基中加入1,25(OH)2D3共培養(yǎng)。④高葡萄糖濃度+Lenti-shVDR組（HG+Lenti-shVDR，HL）

5、：用高濃度葡萄糖培養(yǎng)經(jīng) Lenti-shVDR轉(zhuǎn)染后的 HBZY-1細(xì)胞。⑤高葡萄糖濃度+Lenti-shVDR+1,25(OH)2D3干預(yù)組（HG+Lenti-shVDR+1,25(OH)2D3， HLV）：在高糖培養(yǎng)轉(zhuǎn)染Lenti-shVDR的HBZY-1細(xì)胞的基礎(chǔ)上，向培養(yǎng)基中加入1,25(OH)2D3共培養(yǎng)，流式細(xì)胞周期法檢測各組細(xì)胞的增殖情況，觀察1,25(OH)2D3對高糖介導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果：①

6、倒置顯微鏡下，HBZY-1細(xì)胞在傳代后48小時(shí)呈貼壁生長，長梭形，透明，折光性好，大小均一，形態(tài)一致。但隨著葡萄糖干預(yù)濃度的增高，細(xì)胞密度逐漸增大，偶見發(fā)亮的漂浮細(xì)胞。當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到35mmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖反而被抑制，且漂浮細(xì)胞增多。比較各組細(xì)胞的直徑后發(fā)現(xiàn)，HG25組及 HG35組的 HBZY-1細(xì)胞相較NC組出現(xiàn)了明顯的增大（P<0.05）。臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NG組、HG11組在各時(shí)間點(diǎn)對 HBZY-1細(xì)胞無明顯的增殖促

7、進(jìn)作用；與NG組相比，HG25組在48小時(shí)開始對HBZY-1細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，再增高葡萄糖濃度，HG35組的細(xì)胞增殖反而被抑制（P<0.05)。②MTT法檢測結(jié)果顯示，1,25(OH)2D3對高糖介導(dǎo)的HBZY-1細(xì)胞增殖的抑制作用呈時(shí)間濃度依賴性，當(dāng)濃度達(dá)到1μM/L時(shí)其抑制作用最大化；而當(dāng)1,25(OH)2D3干預(yù)時(shí)間達(dá)到24小時(shí)時(shí)，HBZY-1細(xì)胞的增殖出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的降低，再延長干預(yù)時(shí)間至36小時(shí)，其抑制作用并沒有進(jìn)一步增

8、強(qiáng)（P<0.05）。③流式細(xì)胞周期法檢測結(jié)果顯示，HG組HBZY-1細(xì)胞的S期相比NC組出現(xiàn)了明顯增高，而HV組細(xì)胞的S期較HG組明顯降低，同時(shí)HL及HLV組細(xì)胞的S期則較HV組明顯上升（P<0.05）。
　　結(jié)論：葡萄糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞體外模擬糖尿病腎病的最佳干預(yù)濃度為25mmol/L，1,25(OH)2D3干預(yù)腎小球系膜細(xì)胞的最佳條件為1μM/L干預(yù)24小時(shí)，1,25(OH)2D3能夠有效抑制高糖介導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞的增

9、殖。
　　第二部分1,25(OH)2D3對早期糖尿病腎病模型大鼠腎臟的保護(hù)作用研究
　　目的：觀察1,25(OH)2D3和Lenti-shVDR單獨(dú)或聯(lián)合干預(yù)對早期糖尿病腎病模型大鼠腎臟功能的影響。
　　方法：構(gòu)建大鼠糖尿病腎病模型，隨機(jī)分組為：①正常對照組（normal control,NC組）；②糖尿病腎病組（diabetic nephropathy,DN組）；③糖尿病腎病+1,25(OH)2D3干預(yù)組：（DN+1

10、,25(OH)2D3，DV組）；④糖尿病腎病+Lenti-shVDR干預(yù)組（DN+Lenti-shVDR，DL組）；⑤糖尿病腎病+Lenti-shVDR+1,25(OH)2D3干預(yù)組：（DN+Lenti-shVDR+1,25(OH)2D3，DLV組）。檢測每組大鼠體重、腎重、空腹血糖、血壓、血脂、血鈣；Elisa法檢測大鼠的血和尿中白蛋白、血清高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、甲狀旁腺激素（PTH）、25（OH）D水平；熒光顯微鏡下觀察

11、Lenti-shVDR轉(zhuǎn)染大鼠情況；光鏡下觀察各組大鼠腎臟病理改變，計(jì)算腎臟總體積、平均腎小球體積；透射電子顯微鏡下觀察各組大鼠腎臟改變，測量腎小球基底膜厚度。
　　結(jié)果：①DN組體重相比NC組出現(xiàn)了明顯的減輕，而DN組的腎臟重量（KW）及腎臟與體重的比值（KW/BW）則明顯高于 NC組。在應(yīng)用了1,25(OH)2D3干預(yù)后此效應(yīng)有所減弱。血壓的比較在5組大鼠之間沒有顯著的差異。DN組的大鼠空腹血糖（FPG）、血漿總甘油三酯（TG

12、）及24小時(shí)尿白蛋白水平明顯高于NC組。DV組大鼠24小時(shí)尿白蛋白水平相比DN組有所減弱。DN組大鼠的血清HMGB1水平明顯高于NC組，而DL及DLV組大鼠則顯著高于DV組大鼠。血鈣及血清甲狀旁腺激素水平在DN及NC組之間沒有差異，而DL及DLV組相比NC組則出現(xiàn)了血鈣的下降和甲狀旁腺激素的升高。另外， DN組大鼠的血清25（OH）D水平與NC組及DV組大鼠相比都有明顯下降，同時(shí)DL及DLV組大鼠的血清25（OH）D則比DV組明顯升高（

13、P<0.05）。②無論是肝臟還是腎臟，DL及DLV組的大鼠組織切片在熒光顯微鏡下都可見熒光表達(dá)，而NC組、DN組及DV組則沒有觀察到熒光表達(dá)。③DN組大鼠的總腎體積較NC組大鼠有明顯增大，而DV組大鼠的總腎體積則較DN組大鼠有明顯減小。DN組、DL組及DLV組的平均腎小球體積（MGV）比NC組增大，而DV組的MGV比DN組明顯減小。DN組、DL組及DLV組的腎小球基底膜（GBM）厚度較NC組明顯增厚，而DV組的GBM則較DN組明顯變?。?/p>

14、P<0.05）。
　　結(jié)論：1,25(OH)2D3能夠有效降低早期糖尿病腎病模型大鼠的尿蛋白排泄，有效地減小早期糖尿病腎病模型大鼠的總腎體積、平均腎小球體積及腎小球基底膜厚度，改善及延緩糖尿病腎病的病理發(fā)展。且此效果可能依賴于與其維生素D受體（VDR）的結(jié)合。
　　第三部分1,25(OH)2D3對mTOR介導(dǎo)的早期糖尿病腎病的干預(yù)機(jī)制的研究
　　目的：探討1,25(OH)2D3改善mTOR介導(dǎo)的早期糖尿病腎病的可能機(jī)制

15、。
　　方法：構(gòu)建大鼠糖尿病腎病模型，隨機(jī)分組為：①正常對照組（normal control,NC組）；②糖尿病腎病組（diabetic nephropathy,DN組）；③糖尿病腎病+1,25(OH)2D3干預(yù)組：（DN+1,25(OH)2D3，DV組）；④糖尿病腎病+Lenti-shVDR干預(yù)組（DN+Lenti-shVDR，DL組）；⑤糖尿病腎病+Lenti-shVDR+1,25(OH)2D3干預(yù)組：（DN+Lenti-sh

16、VDR+1,25(OH)2D3，DLV組）。RT-PCR檢測各組大鼠的VDR、DDIT4的mRNA表達(dá)水平；western blot檢測各組大鼠的VDR、DDIT4、TSC2、Akt、mTOR、P70S6K的蛋白及磷酸化表達(dá)水平。
　　結(jié)果：①DN組大鼠VDR及DDIT4的mRNA表達(dá)較NC組明顯降低，而DV組其表達(dá)較DN組明顯升高；DL組及DLV組其VDR和DDIT4的表達(dá)較 NC組明顯降低（P<0.05）。②DN組大鼠 VDR

17、及DDIT4的蛋白表達(dá)水平較NC組明顯降低，而DV組其表達(dá)較DN組明顯升高；DL組及DLV組其VDR和DDIT4的表達(dá)較NC組明顯降低；與NC組相比，TSC2的磷酸化水平在DN組顯著下降，而在DV組則顯著上升；Akt的磷酸化水平則與TSC2截然相反。同時(shí)與NC組相比，mTOR及P70S6K的磷酸化水平在DN組明顯升高，而在DV組則明顯降低。另外我們還觀察到，1,25(OH)2D3對mTOR的抑制作用在VDR基因沉默后消失（P<0.05）