宿主微環(huán)境在肺癌骨轉(zhuǎn)移中的作用及唑來膦酸干預(yù)作用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分 骨間質(zhì)細(xì)胞對(duì)不同骨轉(zhuǎn)移潛能肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 目的：約20-40％的常見腫瘤患者的骨髓中可檢測到播散的腫瘤細(xì)胞,但肺癌、乳腺癌等細(xì)胞易在骨中“定居”,直至變成臨床可見的骨轉(zhuǎn)移,而其他常見腫瘤如胃癌腸癌等,骨轉(zhuǎn)移很少見,因此骨間質(zhì)環(huán)境可能在骨轉(zhuǎn)移中扮演一定作用。我們研究骨間質(zhì)細(xì)胞對(duì)不同骨轉(zhuǎn)移潛能肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,探討其在肺癌骨轉(zhuǎn)移中的作用。 方法：分別利用骨間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液

2、(BSC)、骨髓血的上清液(BM)和常規(guī)培養(yǎng)液(RM)處理具有不同骨轉(zhuǎn)移潛能的肺癌細(xì)胞株H460、A549和SPC-A1。采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞增殖情況,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化及細(xì)胞凋亡率。ELISA的方法比較BSC,BM和RM間文獻(xiàn)報(bào)道與骨轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的濃度差別。 結(jié)果:BSC和BM能明顯增強(qiáng)骨高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株H460的增殖(BM和BSC,與RM相比,P<0.05),而對(duì)骨低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株A549和SPC-A1影響

3、不大(BM和BSC,與RM相比,P>0.05)。人骨髓血的上清液對(duì)很少發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的舌癌細(xì)胞T8113生長無明顯影響,對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901甚至有增殖抑制作用。雙磷酸鹽Zometa(20UM)能阻斷骨髓血上清液對(duì)肺癌細(xì)胞H460的促增殖作用,而P13K特異性的抑制劑Wortmannin(200nM)無明顯抑制作用。H460細(xì)胞經(jīng)BSC和BM處理24小時(shí)后,早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡/繼發(fā)性壞死細(xì)胞的百分比均比RM組明顯降低(P<0.01)

4、,而細(xì)胞周期無明顯差別。ELISA的方法發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β),生長因子(HGF),胰島素生長因子-1(IGF-1),白介素-6(IL-6)和血小板衍生生長因子(PDGF)在BSC,BM,RM組間無明顯差別。 結(jié)論：骨間質(zhì)細(xì)胞的分泌液能促進(jìn)骨高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株H460的增殖,其機(jī)制是通過減少細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)。盡管ELISA的方法未發(fā)現(xiàn)含量特別高的跟腫瘤骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子,但使用更加靈敏和高通量的研究方法,如雙向凝膠電泳聯(lián)合質(zhì)譜,

5、篩選骨間質(zhì)細(xì)胞分泌液中促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移的因子。值得進(jìn)一步研究。 第二部分 使用高通量的技術(shù)平臺(tái)研究肺癌細(xì)胞與骨基質(zhì)的粘附作用 背景和目的:20％左右的肺癌患者能發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，其產(chǎn)生的頑固性疼痛，病理性骨折及脊髓壓迫產(chǎn)生的癱瘓是臨床上的瓶頸問題。肺癌患者中，有的在腫塊很小的時(shí)期就發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，而有的則一直不發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，說明不同類型腫瘤在親骨、定位生長和與骨基質(zhì)粘附方面有明顯差異，而越來越多的證據(jù)顯示，粘附及細(xì)胞粘附分子在腫瘤骨轉(zhuǎn)移中

6、起重要作用。 材料和方法:通過粘附實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)骨高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株H460在骨間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)(HBS)液包被的器皿上的黏附能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)培養(yǎng)液，繼而我們使用基因芯片高通量的技術(shù)平臺(tái)研究H460細(xì)胞與骨間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液粘附后是否能調(diào)節(jié)下游基因的改變。 結(jié)果:Microarray證實(shí)，細(xì)胞株H460在骨間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)(HBS)液包被的器皿上的勃附2小時(shí)和24小時(shí)后，integrin b3, ADAMTS1等31個(gè)基因的表達(dá)持續(xù)上調(diào)。這些

7、基因功能集中在細(xì)胞一細(xì)胞外基質(zhì)黏附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑兩大類。Real-time PCR證實(shí)了基因芯片數(shù)據(jù)的可靠性。 結(jié)論:研究提示，骨高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株H460與骨間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液的黏附作用能激活某些下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和改變黏附相關(guān)分子的表達(dá)，這可能是其易于在骨中生存，進(jìn)而產(chǎn)生骨轉(zhuǎn)移的原因。 第三部分 使用骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型研究唑來膦酸和泰素的聯(lián)合干預(yù)作用 目的:建立人肺腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞株SPC-A-1BM的免疫缺陷小鼠的動(dòng)物模型

8、基礎(chǔ)上比較唑來膦酸鈉聯(lián)合紫杉醇與單用紫杉醇、單用唑來膦酸鈉對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)骨轉(zhuǎn)移荷瘤鼠的治療效應(yīng)，并進(jìn)一步探討雙膦酸鹽可能的作用機(jī)制。 材料與方法:將人肺腺癌骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞株SPC-A-1BM，接種于40只等體重的NIH-BNX小鼠左心室，制成骨轉(zhuǎn)移瘤模型。40只荷瘤小鼠隨機(jī)分為四組，每組10只。接種后第8天開始用藥，分別為唑來膦酸鈉、紫杉醇、唑來膦酸鈉聯(lián)合紫杉醇和生理鹽水對(duì)照，用藥5周。每個(gè)小鼠每周稱體重2次，記錄生存

9、情況。至第8周放血處死小鼠，留取血清樣本，ELISA法檢測血清I型膠原氨基末端肽(NTX)水平;骨ECT核素掃描、X線攝片，檢測骨轉(zhuǎn)移部位和數(shù)量;觀察小鼠肺部、肝、淋巴結(jié)和腎上腺有無轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，用膨脹壓片法計(jì)數(shù)肺部轉(zhuǎn)移灶數(shù)，病理切片檢查。 結(jié)果:對(duì)照組出現(xiàn)明顯體重下降，單藥唑來膦酸組、單藥紫杉醇組與對(duì)照組出現(xiàn)短暫的體重差異，而唑來膦酸聯(lián)合紫杉醇組(聯(lián)合組)體重未下降，與對(duì)照組比自第3周起就有顯著差異(p<0.05 ):核素顯像和X

10、線攝片結(jié)果顯示:治療組與對(duì)照組比骨轉(zhuǎn)移均有顯著差異((p=0.046, p=0.036 )，以唑來膦酸聯(lián)合紫杉醇組骨轉(zhuǎn)移較少:病理結(jié)果顯示:治療組與對(duì)照組比較骨轉(zhuǎn)移有邊緣性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.058 )，以單藥紫杉醇組、唑來膦酸聯(lián)合紫杉醇組骨轉(zhuǎn)移較少;骨轉(zhuǎn)歸生物標(biāo)記物-I型膠原氨基末端肽(NTX)檢測:唑來膦酸組、唑來膦酸聯(lián)合紫杉醇組降低了NTX水平，而以聯(lián)合組與對(duì)照組有顯著差異(p=0.017):并且唑來膦酸聯(lián)合紫杉醇組未見肺轉(zhuǎn)移(p