唑來膦酸體外抗人鼻咽癌細胞作用研究.pdf

1、背景與目的：
　　鼻咽癌(Nasopharyngealcarcinoma,NPC)為中國華南地區(qū)常見的惡性腫瘤,放療或聯(lián)合化放療是主要治療手段。早期患者單純放療5年生存率高達80％以上,晚期患者5年生存僅25%～50%,局部復發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移仍是治療失敗的主要原因,骨轉(zhuǎn)移是最常見轉(zhuǎn)移部位。如何有效控制遠處轉(zhuǎn)移、提高局部控制率是目前研究的熱點。
　　唑來膦酸屬于第3代雙膦酸鹽類藥物,在目前臨床應用的雙膦酸鹽中具有最強的抗骨重吸收能

2、力。在乳腺癌、前列腺癌、骨髓瘤等腫瘤細胞系中,體內(nèi)外試驗已證明唑來膦酸能通過抑制腫瘤細胞的增殖、分化,誘導細胞凋亡,降低腫瘤細胞的遷移、侵襲能力,抑制腫瘤新生血管形成,刺激gdT淋巴細胞增殖等多種途徑直接或間接發(fā)揮其抗腫瘤的作用。唑來膦酸與多種化療藥物聯(lián)合比單用化療藥物可取得更好的抗腫瘤作用。
　　已有臨床研究對唑來膦酸的抗腫瘤作用仍存在爭論。奧地利乳腺癌和結(jié)直腸癌研究組-12(TheAustrianBreast&Colorect

3、alCancerStudyGroupTrial12,ABCSG-12)的結(jié)果表明,唑來膦酸提高早期乳腺癌的無病生存率和無復發(fā)生存率。而英國的AZURE研究顯示唑來膦酸并沒有給乳腺癌患者生存獲益,未能提高患者的無病生存率和總生存率。唑來膦酸對鼻咽腫瘤的臨床治療作用,以及對鼻咽癌細胞系的抗癌作用尚未有研究報道。
　　本課題研究重點主要是通過體外實驗,觀察唑來膦酸對人低分化鼻咽癌HNE-1細胞系增殖、凋亡誘導,侵襲、遷移和管道形成能力的

4、影響,并探討相關的作用機制,為進一步探索唑來膦酸治療鼻咽癌提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　第一部分：唑來膦酸對鼻咽癌HNE-1細胞增殖和凋亡誘導的影響:
　　1.MTT試驗檢測不同濃度唑來膦酸對HNE-1細胞的增殖抑制作用;
　　2.流式細胞術(shù)檢測不同濃度唑來膦酸對HNE-1細胞的凋亡誘導作用;
　　3.流式細胞術(shù)檢測不同濃度唑來膦酸對HNE-1細胞周期分布的影響作用;
　　4.原位末端標記法(TUN

5、EL)檢測不同濃度唑來膦酸對HNE-1細胞凋亡誘導作用;
　　5.實時定量聚合酶鏈反應(RT-Q-PCR)檢測不同濃度唑來膦酸對HNE-1細胞Bcl-2、Bax、Bad和Caspase9mRNA水平的影響;
　　6.Western免疫印跡法(WesternBlot)檢測不同濃度唑來膦酸對HNE-1細胞Bcl-2、Bax、Bad和Caspase9蛋白的影響。
　　第二部分：唑來膦酸對鼻咽癌HNE-1細胞遷移、侵襲和血管擬

6、態(tài)形成的影響:
　　1.Transwell遷移實驗檢測不同濃度唑來膦酸對HNE-1細胞遷移能力的影響;
　　2.Transwell侵襲實驗檢測不同濃度唑來膦酸對HNE-1細胞侵襲能力的影響;
　　3.不同濃度唑來膦酸對HNE-1細胞血管擬態(tài)形成的影響;
　　4.明膠酶譜實驗檢測不同濃度唑來膦酸對HNE-1細胞MMP2、MMP9活性的影響;
　　5.酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測不同濃度唑來膦酸對HNE-

7、1細胞釋放VEGF的影響;
　　6.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測不同濃度唑來膦酸對HNE-1細胞MMP2、MMP9和VEGFmRNA水平的影響;
　　7.WesternBlot法檢測不同濃度唑來膦酸對HNE-1細胞MMP2、MMP9和VEGF蛋白的影響。
　　結(jié)果：
　　第一部分：
　　1.與唑來膦酸對照組(0mmol/L)比較,不同濃度唑來膦酸處理組(2.5mmol/L、5mmol/L、10mm

8、ol/L、20mmol/L、40mmol/L)作用24hr,對HNE-1細胞增殖無抑制作用(P>0.05);作用48hr和72hr均能明顯抑制HNE-1細胞增殖,其中48hr增殖抑制率分別為(3.43±2.46)%、(5.29±4.56)%、(27.25±14.97)%、(32.94±7.54)%和(38.44±11.54)%,72hr增殖抑制率分別為(8.67±3.22)%、(11.79±0.69)%、(32.58±2.28)%、(3

9、9.95±1.95)%和(44.79±2.21)%,與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);但抑制增殖能力與藥物濃度和作用時間未呈時效和量效關系(P>0.05)。
　　2.FCM法檢測不同濃度(0mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L)唑來膦酸處理HNE-1細胞,24hr未能明顯誘導細胞凋亡(P>0.05);48hr早期凋亡率分別為4.0%、14.4%、14.7%和14.1%,與對照組比較差異有

10、統(tǒng)計學意義(P<0.05);72hr早期凋亡率分別為4.5%、11.8%、11.4%和27.8%,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　3.FCM法檢測檢測不同濃度唑來膦酸(0mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L)作用HNE-1細胞48hr,20mmol/L、40mmol/L組HNE-1細胞的S期細胞較對照組比例升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);而10mmol/L組則不明顯。

11、>　　4.TUNEL法染色顯示,凋亡細胞核呈棕褐色顆粒,細胞多呈圓形、少數(shù)形狀不規(guī)則。不同濃度唑來膦酸(0mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L)作用HNE-1細胞48hr,凋亡指數(shù)分別為(3.33±4.25)%、(4.45±2.56)%、(5.55±2.87)%和(5.12±3.14)%,與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);作用72hr凋亡指數(shù)分別為(5.00±5.84)%、(11.67±3.33

12、)%、(16.67±5.29)%和(26.11±4.92)%,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　5.RT-Q-PCR結(jié)果顯示,與對照組比較,不同濃度(10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L)唑來膦酸處理HNE-1細胞48hr,Bad基因的表達量分別為1.77±0.10、3.04±0.24和3.52±0.06;Bcl-2基因的表達量分別為1.03±0.07、0.97±0.11和0.33±0.19;Ba

13、x基因的表達量分別為1.61±0.34、3.36±0.36和4.90±1.89;Caspase9基因的表達量分別2.59±0.12、2.63±0.14和3.39±0.52;與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　6.WesternBlot結(jié)果顯示,經(jīng)不同濃度唑來膦酸(0mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L)處理HNE-1細胞48hr,Bax,Bad和Caspase9的蛋白表達均有不同程度的

14、升高,Bcl-2的蛋白表達則下降。Gel-ProAnalyzer4.0軟件分析結(jié)果顯示,Bad蛋白表達的IOD值分別為606.27±34.46、414.40±3.90、1218.20±11.41和1346.00±18.70;Bax蛋白表達的IOD值分別為270.60±17.25、249.00±15.06、390.87±22.24和573.17±19.04;Caspase9蛋白表達的IOD值分別為731.43±1.80、1595.53±2

15、1.12、1552.10±64.81和1622.80±58.60;Bcl-2蛋白表達的IOD值分別為1175.90±10.86、1246.53±41.35、343.43±9.06和158.27±6.56;與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　第二部分：
　　1.不同濃度(0mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L)唑來膦酸處理HNE-1細胞24hr,其遷移細胞數(shù)分別為121.80±7

16、.09、61.60±10.29、27.80±7.89和19.80±3.35,與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);且不同濃度組間差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其穿膜細胞分別降低(49.80±0.56)%、(77.38±0.25)%和(82.82±1.24)%。
　　2.不同濃度(0mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L)唑來膦酸處理HNE-1細胞24hr,其侵襲細胞數(shù)分別為75.80±2

17、.59、54.80±5.36、44.60±6.43和38.60±8.23,與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);且不同濃度組間差異統(tǒng)計學上也有意義(P<0.05),其穿膜細胞分別降低(28.87±1.29)%、(42.93±2.36)%和(53.69±5.13)%。
　　3.不同濃度(0mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L)唑來膦酸處理HNE-1細胞48hr,HNE-1細胞小管狀結(jié)構(gòu)形成的數(shù)

18、量分別為118.0±9.85、96.00±3.61、59.66±14.36和42.33±2.23,與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);且不同濃度組間差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　4.明膠酶譜試驗結(jié)果顯示,40mmol/L唑來膦酸作用HNE-1細胞24hr,抑制MMP2和MMP9的酶活性,但10mmol/L、20mmol/L組則抑制不明顯。
　　5.不同濃度(0mmol/L、10mmol/L、20mmo

19、l/L、40mmol/L)唑來膦酸處理HNE-1細胞24hr,HNE-1細胞上清中VEGF濃度分別為(5263.86±89.17)pg/ml、(4626.16±30.26)pg/ml、(4154.65±39.65)pg/ml和(1907.76±171.38)pg/ml,與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);且不同濃度組間差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　6.RT-PCR結(jié)果顯示,不同濃度(0mmol/L、10mm

20、ol/L、20mmol/L、40mmol/L)唑來膦酸處理HNE-1細胞24hr,VEGF、MMP2、MMP9三者mRNA的表達均有不同程度的降低。Gel-ProAnalyzer4.0軟件分析結(jié)果顯示,VEGFmRNA表達的IOD值分別為5.17±0.17、4.72±0.30、2.43±0.21和1.13±0.02;MMP2mRNA表達的IOD值分別為4.82±0.13、4.02±0.06、3.59±0.03和2.18±0.02;MMP

21、9mRNA表達的IOD值分別為5.27±0.17、4.99±0.01、4.20±0.01和2.52±0.04;與對照組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　7.WesternBlot結(jié)果顯示,不同濃度(0mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L)唑來膦酸處理HNE-1細胞24hr,VEGF、MMP2和MMP9蛋白表達均有不同程度的降低。Gel-ProAnalyzer4.0軟件分析結(jié)果顯示,VEG

22、F蛋白表達的IOD值分別為2155.60±85.13、1954.33±119.14、1490.76±82.24和1116.30±75.17;MMP2蛋白表達的IOD值分別為511.58±26.27、161.33±12.60、164.87±14.12和56.41±6.03;MMP9蛋白表達的IOD值分別為353.99±22.81、184.43±7.23、93.09±6.65和43.31±5.73;與對照組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.

23、05)。
　　結(jié)論：
　　1.唑來膦酸體外能抑制人鼻咽癌HNE-1細胞增殖、誘導HNE-1細胞凋亡、干擾HNE-1細胞周期分布;
　　2.唑來膦酸通過下調(diào)HNE-1細胞Bcl-2mRNA和蛋白的表達,上調(diào)Bax、Bad和Caspase9mRNA和蛋白表達,誘導其凋亡;
　　3.唑來膦酸體外能抑制HNE-1細胞的遷移、侵襲和血管擬態(tài)形成;
　　4.唑來膦酸通過抑制HNE-1細胞VEGF的分泌,抑制MMP2和M