唑來膦酸抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:探討唑來膦酸(ZOL)對HCT116細(xì)胞的生物學(xué)作用及其分子機(jī)制。
　　方法:1）采用CCK-8方法檢測不同濃度唑來膦酸對HCT116細(xì)胞增殖的作用，不同濃度唑來膦酸孵育HCT116細(xì)胞72h后，測定細(xì)胞存活率，并計(jì)算IC50值;2)采用克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察唑來膦酸對HCT116細(xì)胞克隆形成能力的影響;3）采用流式細(xì)胞分析術(shù)分析25μmol/L和50μmol/L的唑來膦酸作用HCT116細(xì)胞48h后細(xì)胞的凋亡比例;4）25μmo

2、l/L和50μmol/L唑來膦酸作用HCT116細(xì)胞24h、48h和72h后，用線粒體膜電位特異性染料JC-1避光孵育細(xì)胞15min，采用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)分析其紅色熒光強(qiáng)度的變化;5）Western blot方法分析唑來膦酸作用HCT116細(xì)胞72h后，細(xì)胞線粒體內(nèi)和胞漿內(nèi)cytochrome C含量的改變以及胞漿內(nèi)caspase-3的活化情況;6）建立HCT116細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，并觀測給藥唑來膦酸后腫瘤生長、瘤塊重量及腫瘤組

3、織形態(tài)學(xué)的變化。
　　結(jié)果:1）唑來膦酸可抑制HCT116細(xì)胞的增殖，并具有劑量依賴性，IC50=26.79μmol/L;2）IC50濃度的唑來膦酸可顯著抑制HCT116細(xì)胞克隆的形成;3)唑來膦酸25μmol/L和50μmol/L作用HCT116細(xì)胞48h后，HCT116細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡比例分別為11.6％±0.5％、49.2％±3.4％，p＜0.05;4）25μmol/L和50μmol/L唑來膦酸作用HCT116細(xì)胞24h、

4、48h和72h后，熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示JC-1被激發(fā)出的紅色熒光強(qiáng)度顯著降低，流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示被激發(fā)出JC-1紅色熒光的細(xì)胞比例顯著減少:25μmol/L唑來膦酸作用HCT116細(xì)胞24h、48h和72h后，JC-1紅色熒光細(xì)胞的比例分別為96.49％±2.1％、86.13％±3.2％、74.23％±5.3％，p＜0.05;50μmol/L唑來膦酸作用HCT116細(xì)胞24h、48h和72h后，JC-1紅色熒光細(xì)胞的比例分別為55

5、.21％±5.9％、66.65％±2.3％、38.71％±4.3％，p＜0.05;5）Western blot結(jié)果顯示25μmol/L和50μmol/L唑來膦酸作用HCT116細(xì)胞72h后，線粒體中cytochromeC減少，胞漿中cytochromeC增多，同時(shí)，活化的caspase3增多。說明cytochrome C從線粒體內(nèi)釋放至胞漿，并最終激活了Caspase-3;6）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示2mg/kg唑來膦酸治療可顯著抑制小鼠腫瘤生

6、長，末次測量腫瘤體積對照組為2289.4±363.8mm3，唑來膦酸組為926.42±238.3mm3;試驗(yàn)結(jié)束后剝離腫瘤組織，對照組、2mg/kg唑來膦酸治療組的平均瘤重分別為2.53±0.33g、1.65±0.31g，唑來膦酸組腫瘤體積顯著小于對照組，抑瘤率為:34.8％;移植瘤的組織形態(tài)學(xué)檢查顯示唑來膦酸誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論:唑來膦酸能抑制HCT116細(xì)胞增殖和克隆形成，其機(jī)制是通過使線粒體跨膜電位下降，通透性增強(qiáng)