唑來膦酸對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、【研究背景及目的】肺癌是呼吸系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)居高不下,特別是在我國(guó)大中城市呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。臨床上所采用的手術(shù)、放療、化療、微波局部滅活以及分子靶向治療等綜合治療模式使得肺癌患者的生活質(zhì)量及生存期得到一定程度的改善,但5年總生存率只有16％,控制肺癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。唑來膦酸(zoledronic acids)對(duì)惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移的治療效果已經(jīng)在臨床實(shí)踐中得到證實(shí),并作為一線藥物廣泛應(yīng)用。最新的研

2、究結(jié)果表明,唑來膦酸不但可以抑制破骨細(xì)胞的破壞與吸收,還可以直接作用于腫瘤細(xì)胞而發(fā)揮抗腫瘤作用。其機(jī)制涉及唑來膦酸可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡與自噬、抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、預(yù)防腫瘤細(xì)胞對(duì)骨的侵襲與粘附以及降低腫瘤組織中的血管生成。但目前關(guān)于唑來膦酸在肺癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中如何發(fā)揮作用,作用的靶點(diǎn)及其信號(hào)通路還不清楚。已知無論是心肌或者平滑肌等可興奮細(xì)胞,還是腫瘤細(xì)胞等非興奮性細(xì)胞,其細(xì)胞膜表面都存在大量離子通道。離子通道的主要作用是調(diào)控細(xì)胞膜內(nèi)

3、外K+、Na+、Ca2+與Cl-等離子的穩(wěn)態(tài)平衡,對(duì)細(xì)胞的病理及生理過程起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。
　　T型Ca2+通道在許多細(xì)胞膜上均有表達(dá),其可受細(xì)胞膜電位與細(xì)胞漿內(nèi)Ca2+的雙重調(diào)控。T型Ca2+通道的抑制可顯著誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的凋亡。近年的研究已表明,在腫瘤細(xì)胞膜上的T型Ca2+通道也高度表達(dá),并且T型Ca2+通道的異?？赡芘c血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等腫瘤分子標(biāo)志物高度相關(guān),籍此推測(cè)T型Ca2+通道也可能參與

4、了肺癌的發(fā)生與發(fā)展過程。已有實(shí)驗(yàn)提示唑來膦酸可顯著抑制肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的增殖及血管生成,那么是否像VSMCs一樣,唑來膦酸是通過抑制T型Ca2+通道誘導(dǎo)了肺癌細(xì)胞的凋亡抑制細(xì)胞增殖,并且唑來膦酸所引起的T型Ca2+通道抑制是否也調(diào)控了肺癌細(xì)胞的遷移、侵襲與血管形成等過程。為此,我們?cè)诩?xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)兩個(gè)層面設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證唑來膦酸對(duì)肺癌A549細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制。
　　【方法】以體外培養(yǎng)的肺腺癌A549細(xì)胞系進(jìn)行系統(tǒng)的系列實(shí)

5、驗(yàn),觀察唑來膦酸對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞系的凋亡、增殖、遷移、侵襲以及血管形成能力的影響。通過免疫細(xì)胞化學(xué)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,采用MTT與細(xì)胞增殖核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)免疫組化染色法檢測(cè)A549細(xì)胞的增殖能力;通過劃痕實(shí)驗(yàn)與transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)A549細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力;以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial c

6、ells,HUVECs)的體外成環(huán)實(shí)驗(yàn)以及雞胚尿膜囊(chicken embryo allantoids membrane,CAM)實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)血管的生成能力。
　　通過加入T型Ca2+通道抑制劑米貝拉地爾(Mibefradil)來探討唑來膦酸對(duì)肺癌A549細(xì)胞影響的可能機(jī)制。選擇肺腺癌A549細(xì)胞系與轉(zhuǎn)染了T型Ca2+通道α亞基(CaV3.1)的人胚胎腎細(xì)胞293(human embryonic kidney 293,HEK293

7、),利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄唑來膦酸對(duì)T型Ca2+通道電流的影響;并檢測(cè)了A549細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化以探討誘導(dǎo)凋亡發(fā)生的可能機(jī)制。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,我們還建立了A549細(xì)胞的裸鼠種植瘤動(dòng)物模型,觀察唑來膦酸對(duì)肺癌A549細(xì)胞種植瘤的生長(zhǎng)抑制作用,且采用免疫熒光染色法對(duì)裸鼠種植瘤組織的凋亡相關(guān)基因caspase-3、粘附相關(guān)基因E-cadherin與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,

8、VEGF)進(jìn)行了觀察。
　　【結(jié)果】1、唑來膦酸可通過抑制T型Ca2+通道來改變細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,誘導(dǎo)A549肺癌細(xì)胞的凋亡,抑制其增殖:通過膜片鉗技術(shù)我們證實(shí)肺腺癌A549細(xì)胞系上有T型Ca2+通道的存在。唑來膦酸可顯著抑制T型Ca2+通道的活性,而受抑制的T型Ca2+通道可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡,且凋亡具有劑量依賴性與時(shí)間依賴性,其機(jī)制涉及胞內(nèi)Ca2+濃度的升高。我們又把T型Ca2+通道α亞基轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞上,證實(shí)唑來膦酸抑制

9、T型Ca2+通道的作用靶點(diǎn)就在α亞基上。而T型Ca2+通道阻斷劑Mibefradil可協(xié)同增強(qiáng)唑來膦酸的這種作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明唑來膦酸可能通過抑制T型Ca2+通道來促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡,同時(shí)抑制A549細(xì)胞的增殖。
　　2、唑來膦酸通過抑制T型Ca2+通道的作用,降低細(xì)胞的遷移、侵襲以及血管生成能力:我們發(fā)現(xiàn)唑來膦酸可以顯著抑制A549細(xì)胞的遷移與侵襲能力,100μM唑來膦酸作用24h后肺癌細(xì)胞遷移生長(zhǎng)的距離明顯短于對(duì)照組,其

10、遷移率也顯著低于對(duì)照組細(xì)胞(17.3±3.6%vs.75.9±4.7%);A549肺癌細(xì)胞穿過基底膜的數(shù)目顯著減少(17.1±6.6%vs.63.8±8.2%);唑來膦酸處理組的HUVEC生長(zhǎng)緩慢,貼壁后幾乎無移動(dòng),小管形成的數(shù)目明顯減少。唑來膦酸可抑制體外與體內(nèi)血管形成,其中的機(jī)制涉及T型Ca2+通道信號(hào)的抑制,通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有明顯降低HUVECs的體外成環(huán)與CAM的體內(nèi)血管生成的作用。
　　3、唑來膦酸通過抑制T型Ca2+通

11、道抑制A549細(xì)胞裸鼠皮下種植瘤的生長(zhǎng):我們觀察到注射唑來膦酸可抑制A549肺癌細(xì)胞種植瘤的生長(zhǎng),唑來膦酸注射組中裸鼠腫瘤生長(zhǎng)顯著受到抑制,腫瘤組織的體積明顯小于對(duì)照組,且種植瘤組織的凋亡相關(guān)基因caspase-3、粘附相關(guān)基因E-cadherin與血管生成促進(jìn)因子-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)均發(fā)生顯著改變。
　　【結(jié)論】通過細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)唑來膦酸可通過