Trpsl表達(dá)單倍不足通過上調(diào)Arkadia水平促進(jìn)腎臟纖維化.pdf

1、[研究目的]
　　 TRPS1基因突變導(dǎo)致鼻-指-趾綜合征(tricho-rhino-pharyngealsyndrome)其單倍表達(dá)不足導(dǎo)致人類骨骼毛發(fā)發(fā)育異常。研究發(fā)現(xiàn)，其編碼的蛋白Trps1在腎臟發(fā)育過程中起到重要作用。Trps1基因敲除的胚胎小鼠腎臟中腎單位減少，腎臟發(fā)育不全。并且，Trps1作用于Bmp7（BoneMorphogeneticProtein7，骨形成蛋白第7因子）下游，介導(dǎo)由Bmp7誘導(dǎo)的間葉-上皮轉(zhuǎn)換(

2、Mesenchymal-to-epithelialtransition，MET)。Trps1基因敲除的腎臟間葉細(xì)胞不能被Bmp7誘導(dǎo)形成上皮細(xì)胞。鑒于Bmp7具有抑制TGF-beta誘導(dǎo)的上皮-間葉轉(zhuǎn)換(Epithelial-to-mesenchymaltransition，EMT)的作用，并能夠逆轉(zhuǎn)慢性腎損傷導(dǎo)致的腎臟纖維化。但是作為Bmp7下游轉(zhuǎn)錄因子的Trps1是否參與腎臟上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)換，并且其下游作用機(jī)制如何尚不清楚。為

3、解決以上問題，我們在前期的實驗基礎(chǔ)上，從研究Trps1在成年小鼠腎臟的表達(dá)入手，設(shè)計了TGF-beta-Trps1-靶基因-EMT研究軸線，研究Trps1在TGF-beta誘導(dǎo)的EMT過程中的作用，以及Trps1對下游基因的調(diào)控在EMT過程中的作用機(jī)制，為深入研究EMT作用機(jī)制及探討抑制/逆轉(zhuǎn)EMT的可能性提供新的理論支持和實驗依據(jù)。
　　 [研究方法]
　　 1.通過免疫組化、免疫熒光等手段，標(biāo)記Trps1蛋白，檢測T

4、rps1在成年小鼠腎臟中的表達(dá)和分布情況。
　　 2.建立單側(cè)輸尿管結(jié)扎小鼠模型，模擬腎臟纖維化EMT過程，通過檢測腎臟纖維化過程中的各項指標(biāo)，如纖維化程度（Ecad，a-SMA和Coil）及與腎臟纖維化有關(guān)的信號傳導(dǎo)通路(TGF-beta-pSmad3)明確腎臟纖維化與Trps1表達(dá)水平的關(guān)系。
　　 3.原代培養(yǎng)野生型（WT）及Trps1單倍表達(dá)不足(HT)小鼠腎臟近曲小管上皮細(xì)胞，通過TGF-beta誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)

5、生EMT，運(yùn)用real-timePCR，Westernblot，免疫細(xì)胞染色等手段，檢測Trps1在正常表達(dá)及表達(dá)不全(haploinsufficiency)的情況下，對上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的影響，找出Trps1作用的下游目的基因，闡明Trps1調(diào)控EMT的分子機(jī)制。
　　 4.運(yùn)用siRNA(siRNA)干擾Trps1的下游目的基因，通過real-timePCR，Westernblot，免疫細(xì)胞染色等手段干擾Trps1下游目的基

6、因是否能夠抑制/逆轉(zhuǎn)腎臟上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)換。
　　 [實驗結(jié)果]
　　 1.Trps1特異性表達(dá)于小鼠腎臟近曲小管上皮細(xì)胞。我們通過免疫組織化學(xué)染色方法發(fā)現(xiàn)Trps1表達(dá)于成年小鼠腎臟皮質(zhì)。通過與腎小管各個不同節(jié)段的分子標(biāo)的物做對比，我們發(fā)現(xiàn)Trps1特異性表達(dá)于腎臟近曲小管上皮細(xì)胞，其分布范圍與近曲小管上皮細(xì)胞標(biāo)的物villin的范圍一致。并且，同時標(biāo)的Trps1和villin的免疫熒光染色顯示Trps1和vill

7、in共同表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，其分布范圍完全一致。
　　 2.Trps1表達(dá)單倍不足(haploinsufficiency)促進(jìn)單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)導(dǎo)致的腎臟纖維化。UUO導(dǎo)致腎臟間質(zhì)纖維化，表現(xiàn)為腎小管萎縮以及腎小管間基質(zhì)沉積。通過HE染色檢查結(jié)扎過的WT和Trps1HT小鼠腎臟，我們發(fā)現(xiàn)病變腎臟均有不同程度的小管擴(kuò)張，萎縮，間質(zhì)增多以及間質(zhì)細(xì)胞增生。然而，在Trps1表達(dá)單倍不足(HT)情況下，由于UUO導(dǎo)致的間質(zhì)纖維沉

8、積程度加重。通過免疫組織化學(xué)對比發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型膠原染色程度在HT小鼠UUO腎臟中明顯加重（約為WT小鼠UUO腎臟中Ⅰ型膠原的2倍）。以上結(jié)果表明，在Trps1單倍不足加重了由于UUO導(dǎo)致的腎臟纖維化程度。
　　 3.Trps1表達(dá)單倍不足促進(jìn)UUO腎臟纖維化過程中的TGF-beta/Smad3信號傳導(dǎo)通路。由于TGF-beta信號通路是腎臟纖維化過程中最主要的誘導(dǎo)因素，所以我們檢測在Trps1HT小鼠腎臟中纖維化程度加重是否與TGF

9、-beta信號通路有關(guān)。對兩種基因型小鼠的UUO纖維化腎臟進(jìn)行real-timePCR和ELISA檢測TGF-beta后發(fā)現(xiàn)，TGF-beta的mRNA和蛋白水平較陰性對照組均有顯著提高。然而，兩種基因型間對比發(fā)現(xiàn)TGF-beta水平并無顯著差異。然后，我們檢測了Smad3（在纖維化過程中TGF-beta的主要介導(dǎo)因子）的磷酸化水平(pSmad3)。對pSmad3的免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，pSmad3的表達(dá)水平在纖維化腎臟中明顯升高，并且

10、在Trps1單倍不足的情況下pSmad3的水平更高。統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在結(jié)扎后的HT腎臟中Smad3的磷酸化水平是WT的2倍以上。
　　 4.腎臟纖維化程度與Trps1和Smad7蛋白水平相關(guān)。然后，我們在mRNA和蛋白水平檢測了纖維化腎臟中Trps1的表達(dá)情況，以期探尋Trps1和腎臟纖維化的相關(guān)性。經(jīng)過結(jié)扎的腎臟中，Trps1在mRNA和蛋白水平上均較正常腎臟低，表明Trps1表達(dá)水平與腎臟纖維化程度呈負(fù)相關(guān)。另外，我們檢測了Sma

11、d7在mRNA和蛋白水平上的變化。Smad7是TGF-beta信號傳導(dǎo)通路中的重要抑制因子。鑒于在腎臟纖維化過程中Smad2/3的高表達(dá)與Smad7水平降低有關(guān)，我們檢測了在Trps1單倍不足腎臟纖維化過程中出現(xiàn)的Smad3磷酸化水平升高是否與Smad7水平降低有關(guān)？檢測表明，在HT小鼠正常腎臟中Smad7的基礎(chǔ)表達(dá)量就比WT小鼠正常腎臟中的Smad7表達(dá)量低。而且，在結(jié)扎后的HT腎臟中，Smad7蛋白水平繼續(xù)降低，其降低幅度遠(yuǎn)高于在W

12、T腎臟中的降低幅度。以上結(jié)果說明，Trps1的水平與纖維化程度呈負(fù)相關(guān)，并且Trps1表達(dá)量的降低導(dǎo)致Smad7蛋白水平的下降從而加重了腎臟纖維化的程度。
　　 5.Trps1單倍不足促使了TGF-beta誘導(dǎo)的上皮-間葉轉(zhuǎn)換(epithelial-to-mesenchymaltransition，EMT)。為了證實Trps1表達(dá)量的降低真正影響TGF-beta/Smad3信號通路，我們通過原代培養(yǎng)小鼠腎臟近曲小管上皮細(xì)胞(pr

13、oximaltubulecells，PTCs)來檢測在EMT過程中所涉及的各個因子。細(xì)胞生物學(xué)檢測表明，正常和Trps1表達(dá)單倍不足小鼠腎臟上皮細(xì)胞均表現(xiàn)為上皮細(xì)胞特性。然而，經(jīng)TGF-beta誘導(dǎo)后，Trps1表達(dá)單倍不足來源的PTCs(HT-PTCs)中Trps1水平下降程度更大，Smad3磷酸化程度更高，其更易被誘導(dǎo)成為間葉細(xì)胞。Real-timePCR和westernblot分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TGF-beta誘導(dǎo)后HT-PTCs中a-

14、SMA的水平是正常PTCS的2～4倍;相反，E-cadherin的表達(dá)水平下降到正常PTCs的一半左右。并且，在HT-PTCs中Smad7蛋白的下降程度高。以上結(jié)果表明，Trps1單倍不足通過降低Smad7蛋白水平以達(dá)到增強(qiáng)TGF-beta/Smad3信號傳導(dǎo)通路的目的。
　　 6.Trps1單倍不足通過增加Arkadia表達(dá)以降低Smad7蛋白水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Smad7水平降低是由于Smad7蛋白降解增加導(dǎo)致。我們檢測了

15、Smurf1，Smurf2和Arkadia，三個降解Smad7的E3泛素連接酶。研究發(fā)現(xiàn)，在Trps1單倍不足情況下Arkadia表達(dá)水平較高，是正常水平的2倍左右。以上結(jié)果表明，在EM丁過程中Trps1表達(dá)降低，導(dǎo)致E3泛素連接酶Arkadia表達(dá)上升，從而Smad7降解加劇，最終導(dǎo)致Smad7對TGF-beta/Smad3信號傳導(dǎo)通路的抑制作用減弱，TGF-beta誘導(dǎo)上皮-間葉轉(zhuǎn)換的能力增強(qiáng)，纖維化程度加重。
　　 7.A

16、rkadia基因干擾能夠減輕TGF-beta誘導(dǎo)的EMT。應(yīng)用ArkadiasiRNA干擾Arkadia的表達(dá)，我們檢測了WT和HT小鼠腎小管上皮細(xì)胞經(jīng)過ArkadiasiRNA處理后對TGF-beta的反應(yīng)情況。經(jīng)ArkaidasiRNA干擾后，WTPTCs及HTPTCs對TGF-beta的反應(yīng)程度減弱，Smad7蛋白水平恢復(fù)到與WTPTCs相同，EMT過程被抑制。以上結(jié)果表明，ArkadiasiRNA處理能夠通過恢復(fù)Smad7蛋白水