單側(cè)輸尿管梗阻大鼠間質(zhì)纖維化腎臟組織和血漿中microRNA-21的表達(dá)及意義.pdf

1、目的:
　　(1)檢測(cè)MicroRNA-21(miRNA-21)在正常大鼠腎臟組織和血漿中的表達(dá)，并檢測(cè)其在UUO大鼠間質(zhì)纖維化腎臟組織和血漿中的表達(dá)，觀察分析miRNA-21在兩組中的表達(dá)差異。
　　(2)初步探討miRNA-21在TGF-β1/Smad3致大鼠腎間質(zhì)纖維化信號(hào)通路中的機(jī)制。
　　方法:
　　(1)建立UUO大鼠模型:
　　選擇20只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為輸尿管梗阻模型組(UUO組)和假手

2、術(shù)組（Sham組），UUO組大鼠結(jié)扎左側(cè)輸尿管，Sham組只分離左側(cè)輸尿管而不結(jié)扎，別于建模后第3天、第7天各采集兩組5只大鼠血液及腎臟組織進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。
　　(2) miRNA-21檢測(cè)
　　應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time qPCR)方法檢測(cè)腎臟組織及血漿中miRNA-21的表達(dá)變化:UUO組和Sham組大鼠第3天及第7天腎臟組織RNA抽提按照Trizol試劑說明書進(jìn)行，并使用紫外吸收對(duì)抽提出的RNA進(jìn)行純度和

3、濃度檢測(cè)，使用抽提出的腎臟組織RNA進(jìn)行cDNA合成，配備RT反應(yīng)液后在PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行RT反應(yīng)，各樣品的目的miRNA和內(nèi)參(U6)分別進(jìn)行Real-time qPCR反應(yīng)，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析，Sham組2-ΔΔCT為1作為基準(zhǔn)校正。血漿microRNA-21檢測(cè):使用TRI Reagent BD抽提血漿RNA，其余檢測(cè)方法同上。
　　(3)腎臟組織病理觀察
　　腎臟組織常規(guī)進(jìn)行包埋及切片，采用HE、masso

4、n染色和免疫組化技術(shù)評(píng)價(jià)腎組織間質(zhì)纖維化程度，使用免疫組化檢測(cè)腎臟組織中TGF-β1、Smad3、Ⅰ型膠原蛋白(collagenⅠ，Col-Ⅰ)和α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)蛋白表達(dá)情況。
　　(4)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間計(jì)量資料數(shù)據(jù)以(x)±s表示，采用單因素方差分析，方差齊性組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，若方差不齊采用Dunnett's T3法，相關(guān)性分析采用Spearman法，P＜

5、0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　(1)兩組大鼠microRNA-21表達(dá)的變化
　　建模后第3天和第7天UUO組腎臟組織和血漿中miRNA-21與Sham比較均升高（P均=0.000），7天UUO腎組織和血漿中miRNA-21與3天UUO相比升高(P=0.008和P=0.024)，但血漿中miRNA-21表達(dá)水平不如腎臟組織明顯。
　　(2)兩組大鼠腎臟組織病理學(xué)觀察
　　觀察HE染色切片，S

6、ham組腎單位大小、形態(tài)均未見異常，UUO組建模后3天見腎小管輕度擴(kuò)張、小管上皮空泡樣變，間質(zhì)輕度水腫并散在炎性細(xì)胞，建模后7天即可觀察到明顯的腎間質(zhì)增寬、膠原沉積增加、腎小管萎縮等，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，證明建模成功。
　　觀察masson染色大鼠腎臟組織，Sham組第3天和第7天masson染色無(wú)變化，腎單位及間質(zhì)未見異常。UUO組建模后第3天，可見腎小管管腔輕度擴(kuò)張，部分間質(zhì)可見少量淡藍(lán)色膠原組織沉積，UUO組建模后第7天，腎小

7、管較3天模型組明顯擴(kuò)張，間質(zhì)水腫增寬明顯伴單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞廣泛浸潤(rùn)，間質(zhì)膠原纖維進(jìn)行性增多、面積擴(kuò)大、藍(lán)染加重。3天UUO組、7天UUO組、3天Sham組和7天Sham組的masson染色膠原陽(yáng)性面積評(píng)分組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=194.228，P=0.000)，UUO組3天和7天腎臟組織纖維化程度評(píng)分明顯高于同時(shí)期Sham組(P=0.000和P=0.000)，UUO組7天纖維化面積與3天相比顯著增多(P=0.000)。
　　S

8、ham組大鼠3天及7天腎臟組織中TGF-β1僅在腎小管上皮細(xì)胞中少量表達(dá)，間質(zhì)中無(wú)表達(dá)，且各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯變化。與Sham組相比，UUO組3天、7天TGF-β1在腎小管上皮細(xì)胞和組織間質(zhì)表達(dá)面積隨時(shí)間逐漸增多，陽(yáng)性染色逐漸加深。3天UUO組、7天UUO組、3天Sham組和7天Sham組的腎臟組織TGF-β1陽(yáng)性面積組間存在顯著差異(F=423.844，P=0.000)，UUO組TGF-β1陽(yáng)性面積與同時(shí)期Sham組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P=

9、0.000和P=0.000)，UUO7天TGF-β1陽(yáng)性面積較UUO3天組增多(P=0.000)。
　　Sham組大鼠3天及7天腎臟組織中Smad3蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，表達(dá)于少部分腎小管上皮細(xì)胞中。UUO組3天、7天Smad3與Sham組相比，在腎小管上皮細(xì)胞、組織間質(zhì)表達(dá)面積明顯增多，且強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)于UUO組7天組織。3天UUO組、7天UUO組、3天Sham組和7天Sham組的腎臟組織Smad3陽(yáng)性面積組間存在顯著差異（F=768

10、.544，P=0.000），兩兩比較UUO組Smad3陽(yáng)性面積明顯多于同時(shí)期Sham組(P=0.000和P=0.000)，UUO7天Smad3陽(yáng)性面積多于UUO3天(P=0.000)。
　　Sham組Col-Ⅰ在腎小管間質(zhì)少量表達(dá)，與同時(shí)間Sham組比較，UUO組大鼠腎臟組織Col-Ⅰ蛋白表達(dá)面積明顯增多，建模后時(shí)間越長(zhǎng)，陽(yáng)性面積表達(dá)越多。組間Col-Ⅰ表達(dá)面積具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1108.079，P=0.000)，各組間兩兩

11、比較，UUO組Col-Ⅰ陽(yáng)性面積多于同時(shí)期Sham組（P=0.000），UUO7天Col-Ⅰ陽(yáng)性面積多于UUO3天(P=0.000)。
　　α-SMA在Sham組陽(yáng)性面積較少，UUO組α-SMA在腎組織間質(zhì)中表達(dá)面積隨建模后時(shí)間延長(zhǎng)增多，7天陽(yáng)性染色最深。組間α-SMA表達(dá)面積具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=292.363，P=0.000)，各組間兩兩比較，UUO組α-SMA陽(yáng)性面積多于同時(shí)期Sham組(P=0.000)，UUO7天α-S

12、MA陽(yáng)性面積明顯較UUO3天增多(P=0.000)。
　　(3) MicroRNA-21與組織纖維化相關(guān)性分析
　　UUO組腎組織和血漿中miRNA-21的表達(dá)與腎間質(zhì)纖維化評(píng)分正相關(guān)(r=0.816、r=0.907，P均=0.000);腎組織miRNA-21與TGF-β1、Smad3、Col-Ⅰ、α-SMA蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.799、r=0.849、r=0.888、r=0.882，P均=0.000);血漿miRNA-