血漿microRNA-29c在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化模型中的表達及意義.pdf

1、研究背景:
　　慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)是許多病因?qū)е碌倪M行性疾病，發(fā)病的早期大多數(shù)無臨床癥狀，由于腎臟的儲備功能，早期血肌酐常維持在正常范圍內(nèi)，一旦出現(xiàn)臨床癥狀或血肌酐明顯升高，疾病往往是發(fā)展到中晚期階段。在慢性腎臟病發(fā)病的早期予以診斷并給予治療，延長腎臟壽命，推遲或避免行腎臟替代治療，是提高患者生活質(zhì)量、延長生命、減少腎臟替代治療并發(fā)癥的關(guān)鍵，同時也是減輕家庭和社會負(fù)擔(dān)的重要舉措。

2、r>　　腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是進行性腎臟病發(fā)生和發(fā)展過程中腎臟組織發(fā)生的主要病理改變，是許多病因?qū)е履I功能衰竭的共同途徑。研究證實，轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factorbeta，TGF-β)/Samds信號通路通過調(diào)控miRNA參與RIF的發(fā)生。
　　研究目的:
　　本研究通過檢測建模后3、7天末假手術(shù)(sham operation，

3、Sham)組和單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral urethral obstruction，UUO)組血漿及術(shù)側(cè)腎臟組織中microRNA-29c(miR-29c)、術(shù)側(cè)腎臟組織RIF程度、纖維化相關(guān)指標(biāo):E-鈣蛋白(E-cadherin)、膠原蛋白-Ⅰ(collagen protein-Ⅰ，Col-Ⅰ)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、TGF-β1、Smad3蛋白的表達水平。分析miR-29c與RIF程度、E-cadherin、C

4、ol-Ⅰ、α-SMA、TGF-β1、Smad3蛋白之間的關(guān)系。探討miR-29c作為診斷RIF特異性循環(huán)學(xué)診斷標(biāo)志物的可能性;擬進一步闡明RIF的病理機制，為臨床防治RIF提供相應(yīng)的理論和新的治療靶點。
　　研究方法:
　　1.UUO模型的建立:20只SD雄性大鼠隨機分為2組，即Sham組和UUO組，各組10只。3％戊巴比妥鈉溶液按0.5ml/100g腹腔注射麻醉，取左側(cè)腹腎區(qū)約2-3cm切口進入腹腔，找到左側(cè)髂血脈，根據(jù)輸

5、尿管跨過髂血管的解剖標(biāo)志，找到左側(cè)輸尿管并游離至腎盂處，UUO組分別于近左腎盂處和輸尿管上1/3水平處使用0號絲線結(jié)扎，Sham組僅游離左側(cè)輸尿管不結(jié)扎，逐層縫合腹壁，術(shù)后將2組大鼠放置于清潔干燥環(huán)境中，自由進食水，兩組大鼠均在同等條件下飼養(yǎng)。
　　2.大鼠血液及術(shù)側(cè)腎臟組織標(biāo)本獲取:術(shù)后第3、7天末，分別從2組大鼠中隨機抽取5只大鼠，3％戊巴比妥鈉溶液按0.5ml/100g腹腔注射麻醉，麻醉滿意后，以組織剪于腹壁正中縱行剪開腹腔

6、和胸腔，游離出心臟，采血針從心尖部位插入左心室，取血2-3ml置于EDTA抗凝管中，1200r/min離心后分離出血漿，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，取血完畢后立即將灌注針于采血針部位插入至主動脈弓，使用冰鹽水行心臟灌注，直至雙側(cè)腎臟變蒼白，然后取出術(shù)側(cè)腎臟，獲取約2mm厚腎臟組織，分別置于4％多聚甲醛液和RNAlater保存液中，放在-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>　　3.大鼠術(shù)側(cè)腎臟組織病理檢查
　　3.1 Masson、HE染色

7、:對術(shù)后3天末和7天末Sham組和UUO組經(jīng)4％多聚甲醛固定的腎臟組織行Masson、HE染色，HE染色觀察各時間點大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)的改變，判斷建模是否成功;Masson染色主要評估RIF程度，計數(shù)算腎間質(zhì)纖維化指數(shù)(％)，依據(jù)腎間質(zhì)纖維化指數(shù)進行分級，按Banff07RIF評分標(biāo)準(zhǔn)對腎臟組織纖維化程度進行半定量評分:每個標(biāo)本在光鏡下隨機選取10個不重復(fù)的腎皮質(zhì)區(qū)(×200)，進行拍照，采用IPP6.0(Image-Pro Plus6.

8、0)圖像分析軟件計算每個視野纖維化面積占該視野的百分比，根據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)計算每個視野纖維化分值:無損傷，間質(zhì)纖維化少于皮質(zhì)區(qū)5％，0分;輕度損傷，間質(zhì)纖維化占皮質(zhì)區(qū)的6％-25％，1分;中度損傷，間質(zhì)纖維化占皮質(zhì)區(qū)26％-50％，2分;重度損傷，間質(zhì)纖維化大于皮質(zhì)區(qū)50％，3分，把10個視野分值求和后取平均值，得到該切片的纖維化分值。
　　3.2 腎臟組織免疫組化:采用EliVision法，即3μm石蠟切片脫蠟至水，枸櫞酸緩沖液沸水煮

9、20min修復(fù)抗原，3％過氧化氫滅活內(nèi)源性酶，分別加入兔抗人Col-Ⅰ單克隆抗體（1∶200稀釋）、兔抗人E-cadherin單克隆抗體（1∶200稀釋）、兔抗入α-SMA單克隆抗體（1;200稀釋）、兔抗人TGF-β1多克隆抗體(1∶200稀釋)、兔抗人Smad3多克隆抗體（1;200稀釋）后4℃孵育過夜，滴加聚合物增強劑后滴加酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物，DAB顯色，顯微鏡下控制顯色反應(yīng);蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。采用IPP6.0圖像分析軟件

10、，每個標(biāo)本隨機選取10個不重復(fù)視野(×200)，所有抗體陽性表達部位呈黃色，計算每個視野中陽性面積所占視野的百分比。
　　4.血漿及腎臟組織miR-29c表達的測定:經(jīng)勻漿、兩相分離、RNA沉淀、RNA清洗、重新溶解RNA沉淀步驟提取血漿及腎臟組織中的樣品RNA;以RNA為模板、RT混合液為反應(yīng)液、使用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)擴增儀進行RT反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

11、將所有cDNA樣品分別配置qRT-PCR反應(yīng)體系。體系配置如下:2×Master Mix5μl，10uM的PCR特異引物F0.5μl，10uM的PCR特異引物R0.5μl,加水至總體積為8μl，將溶液混合，5000r/min短暫離心。將8ul混合液加到384-PCR板對應(yīng)的每個孔中，再加入對應(yīng)的2μlcDNA，粘上Sealing Film封口膜，并短暫離心混合。將上述384-PCR板置于qRT-PCR儀上進行PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后對

12、PCR產(chǎn)物進行溶解曲線分析，以U6為內(nèi)參，3天對照組為基準(zhǔn)，結(jié)果采用2-△△CT表示。
　　5.統(tǒng)計學(xué)分析:采用SPSS13.0軟件系統(tǒng)分析。所有計量數(shù)據(jù)均以x±s表示，兩組間比較采用完全隨機設(shè)計t檢驗，相關(guān)性分析采用spearman相關(guān)系數(shù)進行分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　1.Sham組，術(shù)后3天和7天末術(shù)側(cè)腎臟與對側(cè)腎臟比較無明顯變化:腎臟無增大、無積水;UUO組，術(shù)后3天和7天末術(shù)

13、側(cè)腎臟較對側(cè)明顯增大，有明顯腎積水，術(shù)后7天末相對術(shù)后3天末腎臟增大和腎積水更加明顯;
　　2.觀察HE染色切片:Sham組術(shù)后3天、7天末腎單位大小、形態(tài)均未見異常，UUO組術(shù)后3天末見腎小管輕度擴張、小管上皮空泡樣變，間質(zhì)輕度水腫并散在炎性細(xì)胞，術(shù)后7天末即可觀察到明顯的腎間質(zhì)增寬、膠原沉積增加、腎小管萎縮、炎癥細(xì)胞浸潤明顯;
　　3.觀察Masson染色切片，Sham組術(shù)后3天和7天末Masson染色無變化，腎單位及間

14、質(zhì)未見異常。UUO組術(shù)后3天末，可見腎小管管腔輕度擴張，部分間質(zhì)可見少量淡藍色膠原組織沉積，UUO組術(shù)后7天末，腎小管較3天末明顯擴張，間質(zhì)水腫增寬明顯伴單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞廣泛浸潤，間質(zhì)膠原纖維進行性增多、面積擴大、藍染加重;
　　4.兩組術(shù)后同時間點比較，UUO組RIF半定量評分顯著高于Sham組(P＜0.01)，血漿及腎臟組織中miR-29c和組織中E-cadherin的表達量顯著低于Sham組(P＜0.01)，組織中Col-

15、Ⅰ、α-SMA、TGF-β1及Smad3蛋白的表達量顯著高于Sham組(P＜0.01);
　　5.UUO組術(shù)后7天末與3天末比較，RIF半定量評分顯著增加(P＜0.01)，血漿和腎臟組織miR-29c以及組織E-cadherin表達量均是顯著降低(P＜0.01)，組織中Col-Ⅰ、α-SMA、TGF-β1及Smad3蛋白表達量顯著升高(P＜0.01)，Sham組以上指標(biāo)均無變化;
　　6.相關(guān)性分析:UUO組血漿和組織中mi

16、R-29c表達量一致性下降，與組織中E-cadherin表達量的下降呈正相關(guān)(r=0.633、0.672，P＜0.01)，與RIF程度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.581、-0.712，P＜0.01)，與組織Col-Ⅰ、α-SMA、TGF-β1及Smad3蛋白表達量的升高呈負(fù)相關(guān)(r=-0.812、-0.779;-0.774、-0.781;-0.741、-0.682;-0.695、-0.594; P＜0.01)。
　　研究結(jié)論:
　　

17、1.從術(shù)側(cè)腎臟外觀、腎臟組織HE、Masson染色、免疫組化觀察證明建模成功;
　　2.術(shù)后7天末和3天末比較，Sham組腎間質(zhì)無明顯纖維化，血漿及腎臟組織miR-29c無明顯改變;UUO組RIF明顯增加，miR-29c明顯降低，并與組織E-cadherin的降低呈正相關(guān)，與組織Col-Ⅰ、α-SMA、TGF-β1及Smad3蛋白的升高呈負(fù)相關(guān)，由此推斷血漿中miR-29c可能是通過TGF-β1/Smad3信號傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)參與R