次氯酸修飾白蛋白對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟線粒體功能及腎間質(zhì)纖維化的影響.pdf

1、目的：本研究以大鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎為腎間質(zhì)纖維化模型，旨在驗(yàn)證我們提出的假說:HOCl-alb誘導(dǎo)線粒體氧化應(yīng)激損傷，促使線粒體功能障礙，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加速腎間質(zhì)纖維化，SS肽可能減輕HOCl-alb所致的腎臟線粒體氧化損傷，從而起到了保護(hù)腎臟的作用。
　　方法：一、無內(nèi)毒素HOCl修飾的大鼠血清白蛋白(HOCl-RSA)的制備和鑒定:將純化的無內(nèi)毒素大鼠血清白蛋白(RSA)溶液與HOCl(200 mmol/L)按照

2、1∶140摩爾比混合，室溫避光孵育30分鐘。制備的HOCl-RSA裝入透析袋，在4℃無菌PBS溶液中透析24小時(shí)，每隔4-6小時(shí)換一次新配制的無菌PBS溶液，以去除游離的次氯酸。透析結(jié)束后，用除菌濾器過濾除菌，應(yīng)用內(nèi)毒素去除膠柱去除內(nèi)毒素。配制過程中所有玻璃器皿均經(jīng)180℃烘烤4小時(shí)去內(nèi)毒素處理。利用鱟試驗(yàn)法內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)制備的HOCl-RSA內(nèi)毒素水平，并證實(shí)內(nèi)毒素水平低于0.025 Eu/ml。體外制備的HOCl-RSA濃度為

3、5.3±0.4 nmol/mg蛋白質(zhì)，對(duì)照樣本的HOCl-RSA含量為0.2±0.03 nmol/mg蛋白質(zhì)。
　　二、SS肽的合成和進(jìn)入線粒體的鑒定
　　1.SS肽的合成
　　SS肽由杭州中肽公司協(xié)助合成，SS肽氨基酸序列和化學(xué)結(jié)構(gòu)各個(gè)SS肽氨基酸序列如下:SS-02(Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2，Dmt=2'，6'-dimethyltyrosine)，SS-31(D-Arg-Dmt-Lys-Phe-N

4、H2)。
　　2.線粒體提取
　　取腎組織（皮質(zhì)）100mg，按照試劑盒說明書提取線粒體。
　　3.SS肽體外進(jìn)入線粒體的鑒定
　　三、動(dòng)物模型建立和分組
　　1.單側(cè)輸尿管梗阻模型(UUO)建立:雄性SD大鼠（購(gòu)自xx實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），初始體重180-220 g，在恒溫清潔環(huán)境（南方醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，以3％戊巴比妥鈉0.15 ml/kg腹腔麻醉，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，剪毛后常規(guī)

5、碘酒酒精消毒，行腹中線切口（切口長(zhǎng)度3-4 cm左右），逐層切開皮膚、肌肉及腹壁各層，鹽水紗布把腸包到旁邊，暴露左腎，向下探尋左側(cè)髂血管（左輸尿管跨過左髂總動(dòng)脈），尋找到左輸尿管并游離，分別在輸尿管上1/3處和中1/3處用4-0號(hào)絲線結(jié)扎，在兩結(jié)扎點(diǎn)之間切斷輸尿管防止逆行性感染，逐層縫合關(guān)腹。假手術(shù)組僅將輸尿管游離但不結(jié)扎離斷。手術(shù)過程注意無菌操作原則。
　　2.動(dòng)物分組
　　(1)假手術(shù)對(duì)照組:假手術(shù)組僅將輸尿管游離但不結(jié)

6、扎離斷;
　　(2)UUO大鼠+生理鹽水注射組:尾靜脈注射同UUO大鼠+RSA注射組及UUO大鼠+HOCl-RSA注射組等體積的生理鹽水:1次/日;
　　(3)UUO大鼠+RSA注射組:尾靜脈注射未經(jīng)修飾的正常大鼠白蛋白:RSA100 mg/kg，1次/日；
　　四、標(biāo)本留取和指標(biāo)檢測(cè):
　　于分組后第14天麻醉處死動(dòng)物，留取腎組織標(biāo)本，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。
　　1.線粒體損傷指標(biāo)檢測(cè):
　　(1)電鏡觀察

7、腎皮質(zhì)線粒體超微結(jié)構(gòu);
　　(2)差速離心法提取腎皮質(zhì)線粒體，采用JC-1染色法結(jié)合熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)線粒體膜電位;
　　2.氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè):
　　(1)腎皮質(zhì)勻漿的HOCl-alb濃度檢測(cè):以不同濃度氯胺T制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定酸性條件下340 nm處吸光值;
　　(2)采用TBA顯色法檢測(cè)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物硫代巴比妥酸反應(yīng)活性物質(zhì)(TBARS);
　　3.凋亡指標(biāo)檢測(cè):
　　(1)原位末端標(biāo)記法(TUNEL

8、)法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞凋亡及計(jì)數(shù);
　　(2)應(yīng)用Western blotting檢測(cè)腎組織cleaved caspase-3/7/9、PARP-1(89kd)、線粒體及胞漿細(xì)胞色素C;
　　4.纖維化指標(biāo)檢測(cè):
　　(1)腎臟病理觀察:腎組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋、切片，行Masson染色，顯微鏡觀察腎間質(zhì)纖維化病變程度并拍照;
　　(2)Western blot、real-time PCR及免疫組化檢測(cè)Col

9、lagen-Ⅰ、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、Fibronectin。
　　結(jié)果：一、HOCl-alb對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)及功能的影響
　　1.注射HOCl-RSA對(duì)UUO大鼠腎皮質(zhì)線粒體形態(tài)及結(jié)構(gòu)的影響
　　電鏡結(jié)果顯示:與假手術(shù)相比，其他四組UUO大鼠腎皮質(zhì)線粒體均出現(xiàn)不同程度的形態(tài)腫脹，灶性空化，嵴模糊不清甚至消失(P＜0.05)，HOCl-RSA注射進(jìn)一步加重UUO大鼠腎皮質(zhì)線粒體病變(P＜0.05)，SS-31治

10、療可減輕注射HOCl-RSA及UUO手術(shù)引起的腎皮質(zhì)線粒體病變程度加重(P＜0.05)。
　　2.注射HOCl-RSA加重UUO大鼠腎皮質(zhì)線粒體功能障礙
　　(1)注射HOCl-RSA降低UUO大鼠腎皮質(zhì)膜電位
　　與假手術(shù)相比，其他四組UUO大鼠腎臟線粒體膜電位均顯著降低(P＜0.05)，注射HOCl-RSA進(jìn)一步降低UUO大鼠腎皮質(zhì)線粒體膜電位(P＜0.05)，SS-31可改善因注射HOCl-RSA及UUO手術(shù)引起

11、的腎臟線粒體膜電位下降(P＜0.05)。
　　(2)注射HOCl-RSA增加UUO大鼠腎皮質(zhì)線粒體ROS產(chǎn)生
　　與假手術(shù)組相比，其他四組UUO大鼠腎小管線粒體產(chǎn)生的ROS均顯著升高(P＜0.05)，注射HOCl-RSA進(jìn)一步增加了UUO大鼠腎小管線粒體ROS產(chǎn)生(P＜0.05)，SS-31可降低注射HOCl-RSA及UUO手術(shù)引起的腎皮質(zhì)線粒體ROS水平增高（P＜0.05）。
　　二、HOCl-alb對(duì)大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)

12、激的影響
　　1.與假手術(shù)組相比，其他四組UUO大鼠腎組織勻漿HOCl-alb水平均顯著增高(P＜0.05)，注射HOCl-RSA進(jìn)一步增加了UUO大鼠腎組織勻漿HOCl-alb水平，SS-31治療可降低注射HOCl-RSA及UUO手術(shù)引起的腎組織勻漿HOCl-alb水平升高(P＜0.05)。
　　2.與假手術(shù)組相比，其他四組UUO大鼠腎組織勻漿TBARS水平均顯著增高(P＜0.05)，注射HOCl-RSA進(jìn)一步增加了UUO

13、大鼠腎組織勻漿TBARS，SS-31治療可降低注射HOCl-RSA及UUO手術(shù)引起的腎組織勻漿TBARS水平的升高（P＜0.05）。
　　三、HOCl-alb對(duì)腎小管上皮細(xì)胞調(diào)亡的影響
　　1.與假手術(shù)相比，其他四組UUO大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡明顯增多(P＜0.05)，且注射HOCl-RSA可進(jìn)一步增加UUO大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡數(shù)目(P＜0.05)，而SS-31治療可抑制因注射HOCl-RSA及UUO手術(shù)引起的大鼠腎小管上

14、皮細(xì)胞的凋亡增多(P＜0.05)。
　　2.Western結(jié)果顯示:與假手術(shù)相比，其他四組UUO大鼠腎皮質(zhì)線粒體內(nèi)CytoC蛋白水平均顯著降低(P＜0.05)，胞漿CytoC蛋白水平均顯著增高(P＜0.05);注射HOCl-RSA可加劇UUO大鼠腎皮質(zhì)CytoC由線粒體向胞漿轉(zhuǎn)移(P＜0.05)，SS-31治療可阻止因注射HOCl-RSA及UUO手術(shù)引起的腎皮質(zhì)CytoC由線粒體向胞漿轉(zhuǎn)移(P＜0.05)。
　　四、HOCl

15、-alb對(duì)腎間質(zhì)纖維化的影響
　　1.MASSON結(jié)果顯示:假手術(shù)組未見明顯異常，其他四組UUO大鼠腎臟均出現(xiàn)不同程度膠原沉積，HOCl-RSA注射進(jìn)一步加重UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化程度，SS-31治療可減輕因注射HOCl-RSA及UUO手術(shù)引起的腎間質(zhì)膠原沉積增多。
　　2.Western blot與Real-time PCR結(jié)果均顯示:與假手術(shù)相比，其他四組UUO大鼠腎臟Collagen-Ⅰ、Fibronectin、α-S

16、MA水平均顯著增高(P＜0.05)，注射HOCl-RSA進(jìn)一步增加UUO大鼠Collagen-Ⅰ、Fibronectin、α-SMA表達(dá)(P＜0.05)，SS-31治療可改善注射HOCl-RSA及UUO手術(shù)引起纖維化加劇(P＜0.05)。
　　結(jié)論：一、UUO大鼠腎組織氧化應(yīng)激標(biāo)志物明顯增加、線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損、腎間質(zhì)細(xì)胞凋亡和腎間質(zhì)纖維化;
　　二、HOCl-alb是已知的促氧化應(yīng)激介質(zhì)，反復(fù)注射加重UUO大鼠的上述病理