TLR2基因在新生血管形成中的作用.pdf

1、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病已成為導(dǎo)致我國人民死亡的重要原因，盡管介入治療及藥物治療已經(jīng)有了長足發(fā)展，其發(fā)病率仍呈上升趨勢。動脈粥樣硬化是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病發(fā)展病程的重要病理生理改變，動脈粥樣硬化發(fā)生可以累及包括冠狀動脈、顱內(nèi)動脈、下肢動脈在內(nèi)的全身動脈系統(tǒng)，當(dāng)出現(xiàn)血栓、栓塞和各種原因引起的動脈急性閉塞時可導(dǎo)致供血組織缺血，發(fā)病突然，進(jìn)展迅速，導(dǎo)致組織器官缺血壞死甚至危及生命。而目前主要的治療方法是血運(yùn)重建術(shù)和溶栓治療。對于一些冠狀動

2、脈多支彌漫性病變，及介入治療后冠狀動脈再狹窄的患者來說，這兩種治療方法難以取得顯著的效果，同時兩種治療方法均有不容忽視的并發(fā)癥及禁忌癥，因此有必要探索新的治療方法。
　　 在組織缺血損傷的情況下能夠逐漸建立起自身的側(cè)枝循環(huán)，以適應(yīng)或抵御局部的缺血缺氧。側(cè)枝循環(huán)的建立可以減少缺血面積，改善功能，提高閉塞病人的存活率。但自身的血管再生過程十分緩慢，無法適應(yīng)缺血組織的需要。因此需要人為的增加促血管生成因子而促進(jìn)新生血管的生成，稱為“治

3、療性血管再生”(therapeuticangiogenesis)。
　　 TLRs(toll-likereceptor)受體是一類跨細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)識別受體家族，在機(jī)體炎癥、免疫反應(yīng)和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。而TLR2是TLR受體中重要成員，其編碼基因定位于4號染色體4q32區(qū)，主要在外周血白細(xì)胞表面表達(dá)，可以通過與細(xì)菌和內(nèi)源性配基相互作用，從而激活轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB和AP-1。目前研究表明，在組織發(fā)生缺血損傷后，器官內(nèi)可出現(xiàn)大

4、量的凋亡細(xì)胞，機(jī)體可產(chǎn)生宿主防御及損傷修復(fù)反應(yīng)等一系列免疫反應(yīng)，而炎癥因子的釋放及炎癥細(xì)胞的聚集對組織損傷及血管再生至關(guān)重要。TLR2缺失可導(dǎo)致在腎臟缺血再灌注中腎臟損傷、白細(xì)胞流入、腎小管損傷受到抑制。在體外實驗中，當(dāng)心肌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時，抑制TLR2可以阻斷NF-κB和AP-1的核轉(zhuǎn)運(yùn)。TLR2在肌肉缺血再灌注損傷的恢復(fù)中扮演重要角色。
　　 TLR2信號通路的激活可以促進(jìn)血管新生在多種疾病中被報道。但TLR2與血管再

5、生的研究主要集中在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，如幽門螺旋桿菌通過TLR2來激活MAPK級聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致COX-2依賴性的前列腺素E2(prostaglandinE2，PGE2)釋放，最終引起癌癥細(xì)胞侵入和血管新生。TLR2信號通路與血管新生的密切關(guān)系是否與組織缺血損傷后的損傷和功能恢復(fù)有關(guān)尚待明確。
　　 而既往在TLR2基因與冠心病病人的研究主要集中在TLR2在動脈粥樣斑塊的巨噬細(xì)胞表面的表達(dá)水平增高，與體內(nèi)炎癥水平和動脈粥樣硬化的進(jìn)

6、展密切相關(guān)，TLR2在不穩(wěn)定性心絞痛病人的外周血單核細(xì)胞表面表達(dá)顯著上升。對于冠心病病人缺血心肌側(cè)枝循環(huán)情況與TLR2的表達(dá)之間的關(guān)系目前尚無相關(guān)研究。
　　 實驗?zāi)康模?br>　　 本研究以TLR2基因敲除小鼠(TLR2-/-)(C57BL/6種系)和野生型(WT)C57BL/6小鼠為實驗對象，觀察TLR2基因在小鼠急性下肢缺血模型中對組織缺血壞死的作用，以及該信號通路在缺血壞死后的恢復(fù)期中對血管新生作用的效應(yīng)。
　　

7、 本研究觀察冠心病患者中血清TLR2在的表達(dá)水平以及與側(cè)枝循環(huán)血管之間的關(guān)系。
　　 實驗方法：
　　 體外實驗中，以臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)為研究對象，采用劃痕實驗判斷TLR2激動劑Pam3CSK4對內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響；分離小鼠淋巴細(xì)胞種于HUVECs上，經(jīng)Transwell實驗分析Pam3CSK4對HUVECs通透性的影響。體內(nèi)實驗中，取WT和TLR2-/-小鼠(體重在18-25g之間)經(jīng)4％水合氯醛腹腔

8、注射麻醉后，于體視顯微鏡下結(jié)扎左側(cè)股動脈近段、遠(yuǎn)端及其主要分支，右側(cè)股動脈作假手術(shù)處理，僅分離股動靜脈而不結(jié)扎。術(shù)后第1，3，7，14天對小鼠下肢缺血損傷進(jìn)行半定量評估(0分：沒有改變；1分：輕度膚色改變；2分：中到重度膚色改變；3分：壞死；4分：自發(fā)截肢。每組8只)及缺血肢體功能半定量評估(0=腳趾彎曲；1=足底彎曲；2=足底不能彎曲，但無拖拉肢體；3=拖拉肢體)。術(shù)前及術(shù)后第1，3，7和14天小鼠經(jīng)4％水合氯醛腹腔注射麻醉后用激光多

9、普勒灌注成像系統(tǒng)測量雙側(cè)下肢血流灌注值。為探討TLR2基因敲除對缺血后血管新生的影響機(jī)制，術(shù)前及術(shù)后1，3，7和14天兩組各處死等量小鼠，取等量內(nèi)收肌提取蛋白標(biāo)本行WesternBlot測定血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)蛋白的表達(dá)，取腓腸肌標(biāo)本免疫組化染色CD31，CD31標(biāo)記小血管數(shù)。各小鼠處死前眼眶取血，置于抗凝管中，高速離心后取血清，ELISA法測定TNF-α，IL-6表達(dá)。另外，TLR24-/-小鼠和WT小鼠各6只，分別心臟取血，

10、分離淋巴細(xì)胞，行transwell觀察兩組小鼠來源淋巴細(xì)胞跨人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷徙率的差異。
　　 在臨床試驗中，選擇87名于本院心內(nèi)科住院并行冠脈造影的患者，根據(jù)冠脈造影結(jié)果及Rentrop評分分為造影正常組，側(cè)支循環(huán)較差組和側(cè)性循環(huán)較好組3組，所有患者在行冠脈造影前靜脈抽血留取血清樣本，通過ELISA方法檢測血清中TLR2表達(dá)量的情況。
　　 實驗結(jié)果：
　　 體外實驗中，Pam3CSK4處理組內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力

11、明顯增強(qiáng)，Pam3CSK4預(yù)處理HUVECs后，跨HUVECs的淋巴細(xì)胞的數(shù)量與對照組比較明顯增加(102.29±10.60/20X高倍視野和68.69±10.57/20X高倍視野，P<0.001)。在體內(nèi)實驗中，術(shù)后WT組小鼠缺血下肢功能在第3天基本恢復(fù)，而TLR2-/-組小鼠直到第7天以后才消失，術(shù)后第1，3，7天TLR2-/-組缺血肢體功能評分顯著高于WT組(分別為1.88±0.92和1.10±0.85，P=0.011；1.54±

12、0.88和0.81±0.83，P=0.031；1.56±0.53和0.67±0.77，P=0.008)。術(shù)后7，14天TLR2-/-組缺血下肢血流灌注值顯著低于WT組(分別為39.15±3.71和52.40±2.93，P=0.001；33.47±1.69和47.43±4.27，P=0.013)，然而術(shù)后1，3天，兩組間的缺血下肢血流灌注值差別無統(tǒng)計學(xué)意義(24.05±6.69和26.50±9.16，P>0.05；38.14±8.82和3

13、9.61±9.45，P>0.05)。術(shù)后7，14天CD31免疫組化提示兩組間新生小血管數(shù)TLR2-/-組顯著低于WT組(分別為7.63±1.41/40X高倍視野和14.17±4.07/40X高倍視野，P=0.001；7.44±1.423/40X高倍視野和13.67±2.92/40X高倍視野，P<0.001)，提示TLR2-/-小鼠缺血后小血管新生受損。Westernblot提示TLR2-/-小鼠VEGF表達(dá)水平較WT小鼠低，且增加幅度緩

14、慢。ELISA法小鼠外周血提示，TLR2-/-組小鼠不同時期IL-6表達(dá)量均顯著低于WT組小鼠(分別為5.85±0.94ng/ml和11.79±5.80ng/ml，P=0.043；5.80±0.80ng/ml和18.91±7.03ng/ml，P=0.021；5.60±2.39ng/ml和19.95±10.81ng/ml，P=0.003；4.68±0.57ng/ml和13.68±7.80ng/ml，P=0.002)；TLR2-/-組小鼠第

15、1，7，14天TNF-α表達(dá)量均顯著低于WT組小鼠(分別為15.18±5.09ng/ml和50.80±25.97ng/ml，P=0.021；27.35±9.44ng/ml和44.04±9.68ng/ml，P=0.005；35.69±15.16ng/ml和55.74±20.08ng/ml，P=0.046)。測TLR2-/-小鼠和WT小鼠外周血分別提取淋巴細(xì)胞行transwell跨人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷徙實驗，發(fā)現(xiàn)TLR2-/-小鼠淋巴細(xì)胞跨內(nèi)

16、皮細(xì)胞遷移能力較正常WT小鼠下降(60.92±12.27/20X高倍視野和145.07±14.49/20X高倍視野，P<0.001)。
　　 在臨床研究中，患者血清標(biāo)本檢測TLR2水平提示三組間含量無顯著性差別(分別為1380.1±891.36pg/ml，1033.9±860.57pg/ml，1433.8±805.75pg/ml，p>0.05)，但Rentrop評分為3分組患者血清TLR2表達(dá)水平明顯較其他組高(分別為1111.

17、0±848.13pg/ml，1239.8±984.44pg/ml，1103.74±483.62pg/ml，2154.8±837.16pg/ml，p<0.01)，回歸分析提示TLR2同側(cè)支評分間顯著相關(guān)(p<0.05)。
　　 實驗結(jié)論：
　　 1、TLR2激動劑促進(jìn)了HUVECs內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力，增加了HUVECs對于淋巴細(xì)胞的通透性。
　　 2、經(jīng)單側(cè)股動脈結(jié)扎術(shù)建立小鼠急性下肢缺血模型后，與野生型C57BL/

18、6小鼠相比較，TLR2-/-組小鼠術(shù)后缺血肢體功能恢復(fù)速度較慢。這與TLR2-/-小鼠在急性下肢缺血后缺血部位側(cè)枝血管的數(shù)量顯著少于野生型C57BL/6小鼠相關(guān)。
　　 3、TLR2基因敲除小鼠缺血損傷部位的血管新生數(shù)量減少可能與血清炎癥因子TNF-α，IL-6表達(dá)水平較低，缺血部位VEGF濃度較低，及外周血淋巴細(xì)胞的穿透能力下降有關(guān)。
　　 4、冠心病患者血清中TLR2表達(dá)水平與冠脈側(cè)支循環(huán)建立程度明顯相關(guān)，并且TLR