TLR2的輻射防護(hù)作用及其初步分子機(jī)制研究.pdf

1、隨著核設(shè)施、核能源的開發(fā)利用，其在造福人類的同時(shí)，也給人類的生命安全帶來隱患。廣島、長(zhǎng)崎原子彈爆炸，切爾諾貝利核電站事故以及2011年發(fā)生的日本福島核泄露事件都說明輻射對(duì)人類的威脅日益嚴(yán)峻，輻射與機(jī)體損傷的研究也越來越受到重視，放射損傷防護(hù)也成為目前輻射生物學(xué)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。
　　2008年《Science》上發(fā)表了一篇TLR5對(duì)于輻射防護(hù)作用的文章。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TLR5作為一種免疫調(diào)節(jié)的重要分子，在機(jī)體輻射敏感性中也發(fā)揮

2、了重要的影響。運(yùn)用TLR5的激動(dòng)劑CBLB502可有效改善小鼠照后的存活率。這一研究引起了國(guó)際廣泛關(guān)注，為人們理解電離輻射了提供了新的視角，為電離輻射的防護(hù)打開了新的思路。
　　Toll樣受體（TLRs）是一類跨膜受體，可通過識(shí)別以及結(jié)合相應(yīng)的PAMPs而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有13種TLR家族成員存在哺乳動(dòng)物中[2]。TLRs介導(dǎo)的信號(hào)通路主要包括My88依賴性以及TRIF依賴型，可通過激活下游的NF-kB以發(fā)揮抗炎，調(diào)

3、節(jié)免疫的作用。TLR2受體屬于TLRs中的一種，過去認(rèn)為其主要在促進(jìn)造血、調(diào)節(jié)免疫方面發(fā)揮作用，對(duì)于電離輻射的影響未見研究。而TLR2與TLR5在作用的下游信號(hào)通路上有共同之處，因此，很可能TLR2也具有和TLR5類似的抗輻射作用。而且，表達(dá)TLR2的細(xì)胞比TLR5的更加廣譜，可識(shí)別大部分廣譜的PAMP，因此研究TLR2與電離輻射相關(guān)性，對(duì)于更好理解TLRs與電離輻射關(guān)系，開發(fā)新的治療方式將有重要的意義。本課題基于TLR2基因敲除小鼠來

4、研究TLR2對(duì)小鼠輻射敏感性的影響，優(yōu)勢(shì)在于可以確定特定基因的性質(zhì)以及研究它對(duì)機(jī)體的影響，是目前基因研究的“金標(biāo)準(zhǔn)”。因此，本研究具有一定的可靠性，并可為下一步機(jī)制研究奠定較好的基礎(chǔ)。
　　研究?jī)?nèi)容：
　　1、TLR2基因敲除對(duì)小鼠照射后存活情況的影響
　　選取野生型小鼠(C57BL/10型，6周，20g)作為對(duì)照，觀察在照射（5.5Gy、6.5Gy、7.5Gy）及未照射條件下與TLR2基因敲除小鼠存活率的差異，并擬合

5、生存曲線；
　　2、激活TLR2對(duì)小鼠照射后存活情況的影響
　　應(yīng)用不同劑量和時(shí)間的TLR2的激動(dòng)劑PAM3，觀察激活TLR2對(duì)小鼠照射后存活情況的影響
　　3、TLR2對(duì)小鼠照后輻射敏感組織損傷的影響
　　取出照后小鼠的胃腸、骨髓、腎、睪丸、肺臟等組織，HE染色觀察兩組小鼠照后組織學(xué)上的差異。
　　4、TLR2對(duì)細(xì)胞照后凋亡、增殖的影響
　　（1）用TUNEL法檢測(cè)TLR2基因敲除小鼠和野生型小鼠照

6、后小腸、睪丸、肺臟組織凋亡的差異；
　?。?）應(yīng)用不同劑量和時(shí)間的TLR2的激動(dòng)劑PAM3處理RAW264.7細(xì)胞系和原代脾臟細(xì)胞，觀察激活TLR2對(duì)細(xì)胞系及原代脾細(xì)胞照射后存活和凋亡情況的影響選取野生型小鼠(C57BL/10型，6周，20g)來源的脾臟細(xì)胞作為對(duì)照，觀察TLR2基因敲除小鼠來源的脾臟細(xì)胞在不同劑量照射后細(xì)胞存活率和凋亡率的變化情況。
　?。?）用BrdU法檢測(cè)TLR2基因敲除小鼠和野生型小鼠照后骨髓有核細(xì)胞

7、增殖能力的差異。
　　5、TLR2輻射防護(hù)作用的初步分子機(jī)制研究
　　主要研究其中是否MyD88依賴性，即采用MyD88基因敲除小鼠，觀察其照后存活率，比較其與野生型小鼠照后存活率差別。
　　6、采用SPSS13.0對(duì)實(shí)驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、TLR2基因敲除增加了小鼠照后死亡率
　?。?）連續(xù)觀察TLR2-/-小鼠12個(gè)月，其存活率與野生型C57BL小鼠相比存活率相同，為1

8、00％，一般狀況良好。TLR2基因?qū)π∈笊媛薀o影響；
　?。?）分別給予TLR2-/-和野生型小鼠5.5Gy、6.5Gy、7.5Gy、8.5Gy照射，連續(xù)觀察30天，記錄其存活情況。第30天時(shí)5.5Gy劑量下野生型小鼠存活率為100%，TLR2-/-為100%；6.5Gy劑量下野生型小鼠存活率為100%，TLR2-/-為60%；7.5Gy劑量下野生型小鼠存活率為60%，TLR2-/-為20%；8.5Gy劑量下野生型小鼠存活率為2

9、0%，TLR2-/-為0(Fig2C)；對(duì)不同劑量照射后30天小鼠存活率進(jìn)行線性曲線擬合，計(jì)算LD50/30，野生型小鼠LD50/30=7.8Gy，TLR2-/-小鼠LD50/30=6.8Gy，DRF=1.15。用Kaplan-Meier生存分析統(tǒng)計(jì)生存率差異，6.5Gy、7.5Gy、8.5Gy劑量組兩種小鼠的存活率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　2、激活TLR2促進(jìn)小鼠照射后存活
　　應(yīng)用不同劑量和時(shí)間的TLR2

10、的激動(dòng)劑PAM3，觀察激活TLR2對(duì)小鼠照射后存活情況的影響：發(fā)現(xiàn)第30天，在7.5Gy照射劑量下對(duì)照組小鼠存活率為60%，而給藥組為100%；8.5Gy照射劑量下，對(duì)照組存活率為20%，給藥組為50%；9.5Gy照射劑量下，對(duì)照組存活率為0，而給藥組是20%；將兩組小鼠30天存活率的生存曲線進(jìn)行擬合，對(duì)照組LD50/30=7.8Gy，給藥組LD50/30=8.7Gy（Fig3D）。該結(jié)果顯示了PAM3作為TLR2受體激動(dòng)劑對(duì)小鼠的輻射

11、防護(hù)作用，也進(jìn)一步確認(rèn)了TLR2在小鼠電離輻射中發(fā)揮的保護(hù)作用。
　　3、TLR2敲除小鼠照后輻射敏感組織損傷的加重
　　小鼠受6.5Gy照射后第5天，取出其骨髓、胃腸、腎臟等輻射敏感組織，HE染色可見野生型小鼠照后骨髓有核細(xì)胞數(shù)量明顯減少，血竇結(jié)構(gòu)紊亂，有部分充血。而TLR2基因敲除小鼠骨髓有核細(xì)胞減少更加明顯，血竇壁崩塌，骨小梁部分增生，說明骨髓損傷較野生型小鼠嚴(yán)重。腎臟HE切片染色可見，野生型小鼠照后第5天腎小球體積增

12、大，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，可見炎性細(xì)胞，毛細(xì)血管狹窄，局部出血。TLR2基因敲除小鼠照后腎臟組織大片充血，腎小球部分萎縮，腎小管部分崩解，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞有不同程度損傷，說明TLR2基因敲除小鼠腎臟損傷較為嚴(yán)重。胃黏膜HE染色，野生型小鼠可見其黏膜大量損壞，粘膜下腺體崩解。TLR2基因敲除小鼠損傷更為嚴(yán)重。
　　4、TLR2敲除增加細(xì)胞照后凋亡、減緩細(xì)胞增殖。
　　（1）將野生型小鼠和TLR2基因敲除小鼠同時(shí)接受6

13、.5Gy照射，照后第5天取出小腸、睪丸、肺等組織進(jìn)行TUNEL原位凋亡檢測(cè)，通過對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)小腸、睪丸組織中TLR2基因敲除小鼠TUNEL陽性率高于野生型小鼠，特別是在小腸隱窩部位，兩者差異更為明顯。在肺組織中，兩者TUNEL陽性率差異則不如小腸和睪丸組織明顯，但是可見到TLR2基因敲除小鼠肺組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)較野生型小鼠多，且可見肺泡組織結(jié)構(gòu)紊亂；
　?。?）激活TLR2對(duì)細(xì)胞輻射損傷有輻射防護(hù)作用，表現(xiàn)為TLR2的激動(dòng)劑PAM3

14、處理的RAW264.7細(xì)胞系和原代脾臟細(xì)胞照射后存活率升高而凋亡率顯著下降。下調(diào)TLR2對(duì)細(xì)胞輻射損傷有加重趨勢(shì)；表現(xiàn)為相比野生型小鼠來源的脾臟細(xì)胞作為對(duì)照，TLR2基因敲除小鼠來源的脾臟細(xì)胞在不同劑量照射后細(xì)胞存活率均更低，凋亡率更高。
　　（3）將TLR2基因敲除小鼠和野生型小鼠進(jìn)行6.5Gy照射，照后第5天取出骨組織，將骨髓切片進(jìn)行BrdU染色。結(jié)果可見TLR2基因敲除小鼠與野生型小鼠未照射情況下BrdU陽性率無明顯差異，但

15、是照射后，TLR2基因敲除小鼠骨髓BrdU陽性率則低于野生型小鼠，說明TLR2基因敲除增強(qiáng)了電離輻射抑制骨髓有核細(xì)胞增殖的作用。
　　5、MyD88對(duì)小鼠輻射敏感性的影響
　　未照射情況下，野生型小鼠和MyD88基因敲除小鼠，連續(xù)觀察12個(gè)月，兩者存活率沒有明顯差別，均為100%。給予6.5Gy照射后，野生型小鼠30天后存活率為100%，但MyD88基因敲除小鼠下降為0。說明MyD88在小鼠電離輻射中發(fā)揮的保護(hù)作用，也佐證T

16、LR2可能通過MyD88途徑發(fā)揮作用。
　　討論分析：
　　輻射生物學(xué)界已對(duì)電離輻射的生物學(xué)防護(hù)進(jìn)行了多年的研究，但是在許多放射損傷中，尤其在急性放射病的治療研究中，仍然沒有良好對(duì)策。大多數(shù)輻射防護(hù)藥物主要用于預(yù)防，而目前對(duì)于電離輻射治療藥物的研究還未取得理想的結(jié)果。自從2008年的《Science》上首次將TLR5受體激動(dòng)劑用于治療急性放射病模型，并取得很好效果后，TLRs與電離輻射之間的關(guān)系開始被人們廣泛關(guān)注。TLR2作

17、為TLRs家族中的一員，其下游通路與TLR5相似，但其表達(dá)的組織較TLR5更多，且能識(shí)別大多數(shù)已知的模式分子。因此，我們相信TLR2對(duì)小鼠電離輻射有著與TLR5類似的關(guān)系，且更具有研究意義。
　　研究小鼠TLR2與電離輻射之間的關(guān)系，我們采用TLR2基因敲除小鼠。“基因敲除”作為基因研究的“金標(biāo)準(zhǔn)”，一直以其可靠性著稱。我們用這樣的實(shí)驗(yàn)材料做研究，理論上結(jié)果更加可信。通過對(duì)比TLR2基因敲除小鼠與野生型小鼠照后生存率的差異，我們確