腺病毒介導(dǎo)的人TLR2和TLR4基因聯(lián)合抗炎作用研究.pdf

1、目的：
　　 膿毒癥是由感染因素所致的全身炎癥反應(yīng),發(fā)病急,病情發(fā)展迅速,病死率高的危重疾病,由于病情復(fù)雜,難于控制。革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜中的脂多糖(LPS)是引起炎癥反應(yīng)的主要致病因子,對(duì)LPS介導(dǎo)的毒性反應(yīng)一直是人們研究的熱點(diǎn)。眾多研究表明,Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)介導(dǎo)的天然免疫在LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起著重要作用,與LPS刺激信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳遞過(guò)程關(guān)系密切,現(xiàn)已證實(shí)多種致炎細(xì)菌成分

2、都直接或間接激活TLR2和TLR4,繼而使白細(xì)胞活化。因此,阻斷或抑制TLR2和TLR4的激活有可能抑制白細(xì)胞的活化,阻斷白細(xì)胞炎性介質(zhì)的合成與分泌,有可能抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)。本課題組前期制備的重組腺病毒AdTLR2,能夠競(jìng)爭(zhēng)抑制白細(xì)胞膜上TLR2的活化,進(jìn)而抑制細(xì)胞炎性因子的表達(dá)水平,顯示出一定的抗炎作用。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建人TLR4胞外區(qū)重組腺病毒AdTLR4,觀察重組腺病毒AdTLR2和AdTLR4聯(lián)合作用于LPS所致細(xì)胞體外模型和動(dòng)

3、物體內(nèi)模型的抗炎效果,為臨床炎癥治療提供新思路。
　　 方法：
　　 1.克隆構(gòu)建
　　 登陸NCBI網(wǎng)站,查找TLR4基因的mRNA序列,利用Oligo軟件設(shè)計(jì)TLR4胞外區(qū)引物,以pUCm-TLR4質(zhì)粒為模板,運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增人TLR4胞外區(qū)目的基因片段。將目的基因克隆至pTA2載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒,通過(guò)酶切分析及測(cè)序結(jié)果鑒定。
　　 2.構(gòu)建重組腺病毒
　　 將測(cè)序正確的TLR4胞外區(qū)基因片

4、段克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV上,構(gòu)建重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-TLR4。PmeⅠ酶切線性化陽(yáng)性克隆,在BJ5183菌內(nèi)完成與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的同源重組以構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAd-TLR4。將鑒定正確的重組質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)在293細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行包裝并大量擴(kuò)增病毒,純化并測(cè)定病毒滴度。RT-PCR方法及Western blot鑒定重組腺病毒表達(dá)活性。
　　 3.觀察重組腺病毒對(duì)經(jīng)LPS處理

5、的THP-1細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子水平的影響
　　 將人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞隨機(jī)分為五組:A組(正常對(duì)照組)、B組(炎癥對(duì)照組:使用LPS刺激細(xì)胞)、C組(重組腺病毒AdTLR2組:LPS刺激細(xì)胞之前用腺病毒感染細(xì)胞)、D組(重組腺病毒AdTLR4組:LPS刺激細(xì)胞之前用腺病毒感染細(xì)胞)、E組(重組腺病毒AdTLR2+AdTLR4組:LPS刺激細(xì)胞之前用腺病毒感染細(xì)胞)。24h后離心收集細(xì)胞懸液,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)

6、對(duì)細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量進(jìn)行檢測(cè),探討AdTLR2和AdTLR4對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞上清細(xì)胞因子水平的影響。
　　 4.觀察重組腺病毒對(duì)LPS所致炎癥小鼠炎癥細(xì)胞因子水平的影響
　　 30只BALB/c小鼠隨機(jī)分成五組:A組(正常對(duì)照組:通過(guò)腹腔注射生理鹽水)、B組(炎癥對(duì)照組:通過(guò)腹腔注射LPS溶液)、C組(重組腺病毒AdTLR2組:LPS致炎成分之前

7、腹腔注射病毒懸液)、D組(重組腺病毒AdTLR4組:LPS致炎成分之前腹腔注射病毒懸液)、E組(重組腺病毒AdTLR2+AdTLR4組:LPS致炎成分之前腹腔注射病毒懸液)。對(duì)小鼠進(jìn)行24h大體觀察(觀察小鼠身體特征和生活習(xí)性的變化)后,眼眶取血,分離血清,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)對(duì)血清中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量進(jìn)行檢測(cè),分析AdTLR2和AdTLR4對(duì)小鼠血清細(xì)胞因子水平變化的影

8、響。
　　 結(jié)果
　　 1.獲取了人TLR4胞外區(qū)目的基因片段
　　 運(yùn)用PCR技術(shù)成功獲取人TLR4胞外區(qū)目的基因片段,并成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pTA2-TLR4。序列分析結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)所克隆的目的片段長(zhǎng)度為1900bp,與GenBank中人TLR4胞外區(qū)基因序列完全吻合。
　　 2.構(gòu)建了重組腺病毒
　　 經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定,重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-TLR4構(gòu)建成功。重組腺病毒質(zhì)

9、粒經(jīng)PacⅠ酶切后可見一條約30kb大小的條帶和一條4.5kb的條帶,表明同源重組成功。將線性化的重組腺病毒質(zhì)粒pAd-TLR4轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后于熒光顯微鏡下可見明亮的綠色熒光,出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),說(shuō)明重組腺病毒包裝成功。擴(kuò)增后收集病毒,純化獲得3.2×109 PFU/mL,的重組腺病毒AdTLR4,經(jīng)RT-PCR及Westernblot檢測(cè)表明感染后細(xì)胞中均有TLR4基因表達(dá)。
　　 3.重組腺病毒對(duì)LPS作用的

10、THP-1細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子的影響
　　 AdTLR2或者AdTLR4單獨(dú)作用于LPS所致炎癥細(xì)胞后,細(xì)胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量較炎癥對(duì)照組顯著降低,不同因子降低的程度不同。AdTLR2+AdTLR4聯(lián)合作用后,上述細(xì)胞因子含量較單獨(dú)作用組進(jìn)一步降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.重組腺病毒對(duì)LPS所致炎癥小鼠炎癥細(xì)胞因子水平的影響
　　 正常對(duì)照組小

11、鼠無(wú)明顯變化;炎癥對(duì)照組小鼠注射LPS后活動(dòng)明顯減少,食欲減退,蜷縮無(wú)力,毛發(fā)無(wú)光澤;單獨(dú)重組腺病毒組和聯(lián)合作用重組腺病毒組小鼠腹腔注射腺病毒后初期活動(dòng)較少,食欲略減少。AdTLR2或AdTLR4單獨(dú)作用LPS所致炎癥小鼠后,血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量較炎癥對(duì)照組顯著降低,不同因子降低的程度不同。而AdTLR2+AdTLR4聯(lián)合作用后,上述細(xì)胞因子含量較AdTLR2或AdTLR4單獨(dú)作用組進(jìn)一步

12、降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1.成功獲取人TLR4胞外區(qū)目的基因片段,經(jīng)測(cè)序及同源性分析表明與GenBank中人TLR4胞外區(qū)基因序列完全吻合。
　　 2.成功構(gòu)建了人TLR4胞外區(qū)基因的重組腺病毒AdTLR4,經(jīng)293細(xì)胞包裝、擴(kuò)增及純化,獲得3.2×109 PFU/ml的高滴度重組腺病毒。
　　 3.在細(xì)胞水平,重組腺病毒AdTLR2和AdTLR4能夠降低LPS所致炎性細(xì)

13、胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量,二者聯(lián)合使用的抗炎效果優(yōu)于AdTLR2或AdTLR4的單獨(dú)作用,提示制備的重組腺病毒能夠分泌sTLR2和sTLR4,能夠有效抑制炎性細(xì)胞的活化,從而減少細(xì)胞因子的釋放,具有一定的抗炎作用。
　　 4.在體內(nèi)重組腺病毒AdTLR2和AdTLR4能夠降低LPS所致炎癥小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量,二者聯(lián)合使用炎癥因子的