TLR2活化對(duì)HBV持續(xù)復(fù)制的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　1.在HBV慢性復(fù)制小鼠模型中,探索TLR2活化能否抑制體內(nèi)HBV復(fù)制。
　　2.在HBV慢性復(fù)制小鼠模型中,探討TLR2活化抑制HBV復(fù)制的機(jī)制。
　　方法:
　　1.TLR2配體Pam3CSK(P3C)小鼠尾根皮下注射。在不同時(shí)間點(diǎn),定量ELISA檢測(cè)小鼠血清中炎癥因子:IL-6、TNF-α和IL-1β等的表達(dá)。
　　2.C57BL/6小鼠高壓尾靜脈注射pAAV/HBV1.2質(zhì)粒建立慢性HB

2、V復(fù)制小鼠模型。在pAAV/HBV1.2質(zhì)粒注射后的早期(day0,day7和day14)或晚期(day14,day21和day28),連續(xù)3次尾根皮下注射P3C處理小鼠。
　　3.按既定實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶采血,并在固定時(shí)間點(diǎn)留取肝脾組織樣本。通過(guò)定量ELISA檢測(cè)小鼠血清炎癥因子(IL-6、TNF-α和IL-1β等)和HBV血清標(biāo)志物(如HBsAg、HBeAg);用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肝組織中HBcAg的表達(dá);用realti

3、mePCR和realtimeRT-PCR分別檢測(cè)血清中HBVDNA水平和肝組織相關(guān)分子mRNA的表達(dá)水平;用ELISPOT檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞中抗原特異性的分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù);通過(guò)細(xì)胞內(nèi)因子染色檢測(cè)PBMCs和脾淋巴細(xì)胞中HBs/HBcpeptide特異性的分泌IFN-γ的CD8+T細(xì)胞陽(yáng)性百分率;用Dimer染色檢測(cè)脾細(xì)胞中HBs/HBcpeptide特異性的CTLs情況。
　　4.使用SPSS18.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用Gr

4、aphPadPrism5作圖。
　　結(jié)果:
　　1.naive小鼠和HBV慢性復(fù)制小鼠經(jīng)尾根皮下注射P3C后,血清中IL-6的產(chǎn)生在注射后3h達(dá)到最高,在24h內(nèi)降至正常水平。并且,血清中IL-6的表達(dá)水平與P3C的處理劑量成正相關(guān)。
　　2.HBV慢性復(fù)制小鼠經(jīng)早期應(yīng)用P3C后,血清中HBsAg、HBeAg及HBVDNA水平明顯降低,小鼠肝內(nèi)HBcAg的表達(dá)也顯著減少。而在P3C晚期處理小鼠中,未發(fā)現(xiàn)明顯的抗HBV效

5、應(yīng)。
　　3.在早期應(yīng)用P3C組和未處理組的小鼠中,脾淋巴細(xì)胞和PBMCs均未能檢測(cè)到HBV特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。僅在第10天,早期應(yīng)用P3C組小鼠的脾淋巴細(xì)胞經(jīng)rHBcAg刺激后分泌IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)量少于對(duì)照組。
　　4.通過(guò)對(duì)小鼠肝組織相關(guān)分子mRNA水平進(jìn)行realtimeRT-PCR檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn):早期應(yīng)用P3C組和對(duì)照組小鼠相比,IFN-β和IFN-γmRNA無(wú)明顯差異;促炎因子IL-6和TNF-αmRNA在第

6、4天明顯高于對(duì)照組;抑炎因子IL-10mRNA在第4天和第10天明顯高于對(duì)照組。
　　結(jié)論:
　　1.naive小鼠和HBV慢性復(fù)制小鼠經(jīng)TLR2配體P3C處理后,血清IL-6等炎癥因子的產(chǎn)生是一個(gè)較快的過(guò)程,一般在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)達(dá)到最高峰,且炎癥因子的濃度與P3C的劑量成正相關(guān)。
　　2.在慢性HBV復(fù)制小鼠模型中,早期應(yīng)用P3C能發(fā)揮明顯的抗HBV效應(yīng),而晚期應(yīng)用則無(wú)此明顯效應(yīng)。
　　3.在慢性HBV復(fù)制小鼠模型