TLR2在大鼠肝細(xì)胞EMT現(xiàn)象中的研究.pdf

1、研究背景與目的：肝纖維化和它的終末階段肝硬化在世界范圍威脅著人類健康。乙型、丙型病毒性肝炎、酒精性肝病及非酒精性肝病所引起的肝纖維化、肝硬化也相當(dāng)常見(jiàn)。研究表明肝硬化是不可逆的，而肝纖維化是可逆的。因此，有效的抗纖維化治療就成了一個(gè)非常緊迫的問(wèn)題。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，也是目前研究的熱點(diǎn)。但是近3年的研究又認(rèn)為肝細(xì)胞在肝纖維化中亦起到非常重要的作用。肝細(xì)胞約占肝臟

2、細(xì)胞總量的80％，數(shù)量最多，功能重要。肝細(xì)胞的炎癥壞死，肝細(xì)胞損傷，脂質(zhì)過(guò)氧化，凋亡等均在促使肝纖維化中起到重要作用。越來(lái)越多研究表明，除HS C在肝纖維化發(fā)生學(xué)中是主要的纖維源性細(xì)胞外，肝細(xì)胞也具有潛在的纖維源性[2]。并且研究認(rèn)為肝細(xì)胞主要是通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞從而促使肝纖維化的形成。TLR作為主要的模式識(shí)別受體,在機(jī)體先天性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用，并在肝臟疾病包括酒精性肝病、病毒性肝炎、肝纖維化等的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮

3、重要作用為此，本論文研究目的旨在揭示肝細(xì)胞EMT 現(xiàn)象中是否有TLR的調(diào)節(jié)作用，以深入闡明肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，也為肝纖維化的早期干預(yù)提供新的思路。
　　 方法：
　　 一、肝細(xì)胞的分離與鑒定雄性Sprague-Darwley大鼠（150g-200g），分離門(mén)靜脈并插管，依次灌注膠原酶，37 ℃原位消化，3次4 ℃水平離心得到肝細(xì)胞，于含10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液。臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞存

4、活率。顯微鏡下觀察死亡與正常的肝細(xì)胞,鑒定肝細(xì)胞成活率。
　　 二、 TGF-β刺激肝細(xì)胞產(chǎn)生EMT 現(xiàn)象當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)基本貼滿皿底時(shí)，以含10％胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液中加入TGF-β(5 ng/mL)作用48 h后，使用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變并拍照。以不加TGF-β組作為對(duì)照組。提取細(xì)胞總RNA，PCR 檢測(cè)E-cad、 vimentin的mRNA表達(dá)。
　　 三、TLR2在肝細(xì)胞EMT 現(xiàn)象中的表

5、達(dá)普通PCR 檢測(cè)E-cad、 vim entin的mRN A表達(dá)后，再檢測(cè)TLR2 mRNA的表達(dá)。四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，數(shù)據(jù)由SPSS 13.0軟件統(tǒng)計(jì)包處理。兩組之間比較用t 檢驗(yàn)，相關(guān)性比較用線性相關(guān)，多組間的比較用One-Way ANOV A 方差分析：方差齊性用LSD 方法比較；方差不齊用Dunnett’s 方法比較。P<0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果：一、肝細(xì)胞鑒定臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定肝細(xì)胞存活

6、率95％以上，能滿足實(shí)驗(yàn)要求。二、TGF-β刺激肝細(xì)胞產(chǎn)生EMT 現(xiàn)象（一）TGF-β刺激肝細(xì)胞對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響TGF-β刺激48小時(shí)的肝細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)由平鋪彌漫的島狀細(xì)胞變成紡錘形間隙較大的細(xì)胞。細(xì)胞逐漸分離。（二）TGF-beta對(duì)肝細(xì)胞EMT 現(xiàn)象相關(guān)指標(biāo)mRNA的影響TGF-β刺激48小時(shí)的肝細(xì)胞的E-cad mRNA表達(dá)明顯低于不加刺激的正常HC的表達(dá)（P<0.05）。而TGF-β刺激48小時(shí)的肝細(xì)胞的vi menTin mRN

7、 A表達(dá)明顯高于不加刺激的正常肝細(xì)胞的表達(dá)（P<0.05）。三、TLR2在肝細(xì)胞EMT 現(xiàn)象中的表達(dá)TGF-β刺激48小時(shí)的肝細(xì)胞的TLR2 mRNA與蛋白水平的表達(dá)明顯高于不加刺激的正常HC的表達(dá)（P<0.05）。
　　 結(jié)論：一、TGF-β刺激肝細(xì)胞可引起肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，E-cad m RNA水平表達(dá)下降，v I m entin mRNA水平表達(dá)上升。提示TGF-β可以促使肝細(xì)胞產(chǎn)生EMT 現(xiàn)象。二、 TGF-β刺激肝細(xì)