TLR2在腦梗死大鼠腦組織中的動態(tài)表達及OMT腦保護機制的研究.pdf

1、目的：缺血性腦血管病是常見病、多發(fā)病，病死率和致殘率高。腦梗死后繼發(fā)性腦損傷的病理生理機制復雜，其中過度炎癥免疫反應(yīng)存在于腦梗死后壞死及缺血區(qū)域，導致炎癥損傷，此已達成共識，因此，減輕炎癥損傷成為治療急性腦梗死的主要途徑之一。然而，抗炎治療在腦梗死的臨床研究中并沒有取得預期效果。尋找炎癥級聯(lián)反應(yīng)上游的始動因素并加以抑制可能為腦梗死的治療帶來新的突破，Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）的發(fā)現(xiàn)促進了人們對炎癥

2、始動機制的理解，其中TLR2的結(jié)構(gòu)及其參與炎癥反應(yīng)、調(diào)解免疫應(yīng)答等方面研究的較為清楚。TLR2不僵在病原微生物性炎癥損傷中起重要作用，也在腦梗死、心肌梗死等非病原微生物性炎癥損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但TLR2在腦組織中的細胞定位一直存在爭議。氧化苦參堿（Oxymatrine，OMT）是從豆科槐屬植物苦參（Scphora flavescens Ait）中提取的生物堿，具有四環(huán)喹嗪啶類結(jié)構(gòu)。OMT具有抗炎、抗氧化、抗病毒及調(diào)節(jié)免疫等多方面藥理作

3、用，但其作用機制尚不完全明確，近幾年對于OMT的研究很多，多集中在抗腫瘤及抗心肌梗死等方面，關(guān)于OMT在腦梗死中作用的研究較少。
　　 本實驗以線栓法建立大鼠大腦中動脈閉塞（middlecerebral artery occlusion，MCAO）模型，應(yīng)用RT-PCR和免疫組織化學技術(shù)測定腦梗死后TLR2的動態(tài)表達規(guī)律；應(yīng)用激光掃描共聚焦技術(shù)研究TLR2在大鼠腦梗死組織中的細胞定位；應(yīng)用OMT作為干預藥物，研究OMT對腦梗死后

4、腦水腫、腦梗死體積及TLR2表達的影響，旨在探討OMT在腦梗死中的腦保護作用及其作用機制。
　　 方法：采用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠，隨機分為4組：假手術(shù)組、大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）組、大劑量OMT治療組（120mg/kg，HOMT）和小劑量OMT治療組（60 mg/kg，LOMT）。根據(jù)不同時間點每組分為6 h、24 h、48 h、72 h

5、四個亞組。應(yīng)用Longa等的線栓法建立大鼠MCAO模型。將OMT以生理鹽水制成濃度為40mg/ml及80mg/ml兩種試劑，HOMT組、LOMT組、MCAO組分別給予80mg/ml OMT溶液120mg/kg、40mg/ml OMT溶液60mg/kg及生理鹽水1.5ml/kg，各組均為腹腔注射給藥，手術(shù)完畢后即刻給藥一次，之后每天給藥一次，直至相應(yīng)時間點斷頭處死動物。假手術(shù)組除不插線栓外其余操作同MCAO組。
　　 應(yīng)用RT-P

6、CR測定TLR2 mRNA的動態(tài)表達，免疫組織化學檢測腦組織TLR2免疫陽性細胞數(shù)，TTC染色測定腦梗死體積，干濕重法檢測腦組織含水量，Confocal技術(shù)觀察TLR2的細胞定位。
　　 結(jié)果：
　　 1.腦組織含水量測定。
　　 用干濕重法測得的腦組織含水量結(jié)果顯示：MCAO組、LOMT組和HOMT組大鼠病變側(cè)腦組織含水量均在術(shù)后6 h開始升高，48 h達高峰，72 h開始下降。Sham組大鼠腦組織含水量無明顯

7、升高。與MCAO組相比，HOMT組的腦組織含水量在24，48和72 h明顯下降（P<0.01）。LOMT組除48 h腦組織含水量有所下降外（P<0.05），術(shù)后其余時間點的腦組織含水量與MCAO組均無統(tǒng)計學差異。
　　 2.腦梗死體積測定。
　　 TTC染色顯示：sham組腦組織均勻紅染無梗死灶，MCAO組可見大面積白色梗死灶，多位于右側(cè)基底節(jié)、頂葉和顳葉皮質(zhì)。腦梗死體積測定顯示：LOMT組腦梗死體積低于MCAO組，但差

8、異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；HOMT組腦梗死體積低于MCAO組及LOMT組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；
　　 3.腦組織TLR2免疫陽性細胞數(shù)及mRNA的動態(tài)表達。
　　 腦組織TLR2免疫陽性細胞結(jié)果顯示：MCAO組、I+OMT組和HOMT組大鼠病變側(cè)TLR2免疫陽性細胞數(shù)均高于sham組，差異有統(tǒng)計學意義（各亞組均P<0.05）；MCAO組6 h陽性細胞開始增加，主要位于腦缺血區(qū)皮層，48 h陽性細胞數(shù)達

9、高峰，主要位于缺血半暗帶區(qū)皮層，72h開始下降；
　　 腦組織TLR2 mRNA表達結(jié)果顯示：MCAO組、LOMT組和HOMT組大鼠病變側(cè)TLR2 mRNA表達均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義（各亞組均P<0.05）；與sham組相比，MCAO后6 h TLR2 mRNA表達即明顯增高，至72 h時達高峰。
　　 4.TLR2的細胞定位。
　　 Confocal結(jié)果顯示，腦梗死后TLR2陽性細胞較假手術(shù)組明顯增多

10、；梗死后6 h，TLR2主要定位于NeuN陽性神經(jīng)元，幾乎不表達于Iba-1陽性小膠質(zhì)細胞及GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞；而梗死后72 h，TLR2主要定位于NeuN陽性神經(jīng)元及Iba-1陽性小膠質(zhì)細胞，幾乎不表達于GFAP陽性星形膠質(zhì)細胞。
　　 5.OMT對腦梗死組織TLR2陽性細胞及mRNA的影響。
　　 TLR2陽性細胞：LOMT各亞組TLR2陽性細胞數(shù)較MCAO組減少，除6 h亞組外，其余亞組差異有統(tǒng)計學意義（P<

11、0.05）；各亞組陽性細胞數(shù)較MCAO組減少，除6 h亞組外，其余亞組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；HOMT 72h亞組低于LOMT組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），6 h、24 h、48 h亞組與LOMT組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　 TLR2 mRNA表達：LOMT 6 h、24 h亞組與MCAO組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），48 h、72 h亞組均低于MCAO組，差異有統(tǒng)計學意義（P<

12、0.05）；HOMT各亞組與MCAO組比較，TLR2 mRNA表達降低，除6 h亞組外，其余亞組差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；HOMT 24h、72 h亞組低于LOMT組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），6 h、48 h亞組與LOMT組比較，差異無統(tǒng)計學意義（p>0.05）。
　　 結(jié)論：腦梗死后TLR2表達升高，在6 h時開始上升，48或72 h時達高峰。腦梗死早期，TLR2上調(diào)可能與急性缺血性神經(jīng)元損傷有關(guān)；腦梗死晚期