脈沖電場(chǎng)介導(dǎo)AT2R基因在血管局部表達(dá)及其對(duì)血管新生內(nèi)膜影響.pdf

1、背景和目的：據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization WHO）統(tǒng)計(jì)，2010年，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┧滤劳稣伎偹劳鋈丝诘?0％，位居第一。隨著經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈球囊成形術(shù)(PTCA)及經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈支架植入術(shù)（PCI）廣泛應(yīng)用于冠心病的治療，使冠心病患者預(yù)后有了顯著改善，死亡率明顯降低，但PTCA及PCI術(shù)后有較高的再狹窄發(fā)生率[2,3]，嚴(yán)重影響了PCI術(shù)的遠(yuǎn)期療效，如何防治再狹窄成為冠心病介入治療的

2、重要課題之一。PTCA或PCI時(shí)，球囊損傷動(dòng)脈內(nèi)皮及中層，引起血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)表型轉(zhuǎn)化、遷移、增殖及細(xì)胞外基質(zhì)合成，形成新生內(nèi)膜，而新生內(nèi)膜的形成和增殖是引起支架內(nèi)再狹窄的主要病理改變。血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）受體主要有兩型,即AngⅡ1型受體即AT1R和AngⅡ2型受體即AT2R。AngⅡ可通過AT1受體的激活發(fā)揮縮血管,促細(xì)胞增生遷移、促進(jìn)新生內(nèi)膜形成、細(xì)胞外基質(zhì)沉積,促發(fā)炎癥、血栓形成及氧化應(yīng)激

3、的效應(yīng)，這些是再狹窄發(fā)生過程中主要因素之一。AT2受體激活則發(fā)揮舒張血管,抗增生抗血栓,誘導(dǎo)凋亡及產(chǎn)生一氧化氮NO的效應(yīng)。因此我們選擇血管緊張素2Ⅱ型受體基因（angⅡtype2 receptor gene，AT2R gene）為靶點(diǎn)來觀察其對(duì)再狹窄后新生內(nèi)膜的影響。
　　體內(nèi)轉(zhuǎn)基因（in vivo）是將目的基因直接導(dǎo)入病變部位細(xì)胞中，目的基因在原位表達(dá)而產(chǎn)生治療效果。是最直接的基因治療方法。但目前的困難主要是很難將目的基因送入血

4、管局部并有效表達(dá)。現(xiàn)在常用基因載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染，常用的基因載體有病毒類載體（如腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）和非病毒類載體（如質(zhì)粒載體、脂質(zhì)體）載體，均距離理想的基因載體有一定的差距。腺病毒載體的毒性及免疫原性使其應(yīng)用于臨床受到限制。更有研究發(fā)現(xiàn)腺病毒載體對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化病灶的轉(zhuǎn)染率低，而其他動(dòng)脈被轉(zhuǎn)染的危險(xiǎn)增加。而且人群對(duì)病毒普遍具備免疫力，病毒載體易被宿主免疫系統(tǒng)清除致使基因表達(dá)時(shí)間短。非病毒類載體以質(zhì)粒DNA為代表。它的主要優(yōu)點(diǎn)是對(duì)

5、攜帶基因的大小無限制，不易引起宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)、不整合入宿主細(xì)胞DNA，缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)染效率低，特別是在活體組織局部轉(zhuǎn)染時(shí)表達(dá)率更低。上世紀(jì)六七十年代，人們開始研究電穿孔法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染，細(xì)胞在電場(chǎng)的作用下可逆或者不可逆的出現(xiàn)細(xì)胞膜穿孔，這些孔道可以幫助基因分子進(jìn)入細(xì)胞，大量研究證實(shí)，電穿孔法可增加基因的轉(zhuǎn)染效果，并增加基因表達(dá)時(shí)間。但該方法多用于體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，在活體組織中應(yīng)用較少，而且查閱大量文獻(xiàn)后活體血管電穿孔的研究比較少，本研究將電

6、穿孔法用于活體血管組織中以達(dá)到增加AT2R在血管局部的過表達(dá)的目的，進(jìn)而觀察AT2R表達(dá)對(duì)大鼠血管損傷后新生內(nèi)膜的影響作用。
　　方法：
　　1．以pUHD-10.3/AT2R質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增AT2R基因的全長(zhǎng)cDNA序列,再將其克隆入載體pEGFP2-N2，構(gòu)建其真核表達(dá)載體pEGFP-N2/AT2R。
　　2．自制用于血管電穿孔的夾子狀血管電極片及活體電穿孔儀器的準(zhǔn)備。
　　3．PTCA球囊損傷法構(gòu)建再

7、狹窄動(dòng)物模型，通過脈沖電場(chǎng)介導(dǎo)pEGFP-AT2R或pEGFP-N2在大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)膜局部表達(dá)。
　　4．免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)AT2R在大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)膜的表達(dá)。
　　5．RT-PCR技術(shù)檢測(cè)AT2R mRNA在大鼠頸總動(dòng)脈的表達(dá)。
　　6．HE染色檢測(cè)AT2R表達(dá)對(duì)大鼠損傷后頸總動(dòng)脈新生內(nèi)膜的影響。
　　結(jié)果：
　　1．pEGFP-N2/AT2R成功構(gòu)建，經(jīng)測(cè)序與基因庫(kù)完全一致。
　　2．自制夾子

8、狀電極片可用于電穿孔法介導(dǎo)重組AT2R真核表達(dá)質(zhì)粒在體轉(zhuǎn)染。
　　3．PTCA球囊損傷法能成功構(gòu)建再狹窄動(dòng)物模型。
　　4．免疫組化檢測(cè)結(jié)果提示脈沖電場(chǎng)能有效介導(dǎo)AT2R在大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)膜表達(dá)，電穿孔轉(zhuǎn)染組的頸總動(dòng)脈內(nèi)膜AT2R的表達(dá)水平顯著高于單純損傷組、空轉(zhuǎn)組和不加電場(chǎng)轉(zhuǎn)染組（P＜0.01）,7d時(shí)仍維持較強(qiáng)表達(dá)，14d后迅速下降,21d時(shí)表達(dá)幾乎消失。
　　5．RT-PCR結(jié)果提示脈沖電場(chǎng)能有效介導(dǎo)AT2R在大鼠

9、頸總動(dòng)脈內(nèi)膜表達(dá)，電穿孔轉(zhuǎn)染組的頸總動(dòng)脈內(nèi)膜AT2R的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組、空轉(zhuǎn)組和不加電場(chǎng)轉(zhuǎn)染組（P＜0.01）,7d時(shí)仍維持較強(qiáng)表達(dá)，14d時(shí)達(dá)到高峰，之后迅速下降,21d時(shí)有微弱表達(dá)。
　　6．HE染色結(jié)果提示：在轉(zhuǎn)染21 d時(shí)，轉(zhuǎn)染組的內(nèi)膜面積與中膜面積比顯著低于單純損傷組和空轉(zhuǎn)組[分別為（0.76±0.08）、（1.39±0.08）、（1.32±0.10），P＜0.01],空轉(zhuǎn)組和單純損傷組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.0