AT2R基因在體轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠頸動(dòng)脈新生內(nèi)膜增生的抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)后再狹窄(RS)作為一個(gè)沒找到答案的“謎”，與PCI發(fā)展相伴相隨，RS的研究成為當(dāng)今心血管病醫(yī)學(xué)界的重點(diǎn)、難點(diǎn)。支架植入術(shù)解決了RS中的血管彈性回縮及負(fù)性重構(gòu)問題，卻增加了血管損傷、血栓形成的危險(xiǎn)及慢性炎癥刺激的發(fā)生，導(dǎo)致內(nèi)膜過度增生，形成支架內(nèi)再狹窄(ISR)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)冠脈內(nèi)放射治療能有效地防止RS，但存在晚期血栓形成及“邊緣效應(yīng)”等問題，影響了其臨床應(yīng)用。目前藥物涂層支架的應(yīng)用能

2、顯著降低RS發(fā)生率，但半年內(nèi)RS的發(fā)生率仍有10％左右，且其遠(yuǎn)期療效有待大規(guī)模臨床試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)；與RS相關(guān)的基因研究，仍是解決RS的關(guān)鍵所在。RS的突出病理改變是新生內(nèi)膜增生，對(duì)新生內(nèi)膜增生的發(fā)生機(jī)制及防治研究已成為攻破RS的突破口。血管損傷引發(fā)了平滑肌細(xì)胞(VSMC)的表型轉(zhuǎn)化，使處于靜止?fàn)顟B(tài)的VSMC重新獲得增殖和遷移能力，突破內(nèi)彈力膜從血管中膜進(jìn)入內(nèi)膜并在內(nèi)膜中大量增殖，同時(shí)分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)新生內(nèi)膜形成，血管局部腎素血管

3、緊張素系統(tǒng)參與了此過程。AngⅡ1型受體(AT1R)介導(dǎo)了AngⅡ的促進(jìn)VSMC增殖、遷移、抑制凋亡的作用；AngⅡ2型受體(AT2R)具有拮抗AT1R的作用，從而推測(cè)AT2R介導(dǎo)了抑制新生內(nèi)膜增生的作用。AT2R在胚胎組織中含量豐富，出生后表達(dá)迅速下降；在血管損傷、炎癥、自發(fā)性高血壓病理?xiàng)l件下，血管局部AT2R重新表達(dá)，提示AT2R可能參與了血管損傷后的結(jié)構(gòu)重塑過程。雖然有報(bào)道示，AT2R可抑制AT1R激活的胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK(p

4、42和p44MAPK)信號(hào)通路，下調(diào)VSMC的AT1R、PDGFR-β及TGF-βⅠ型受體表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖及胞外基質(zhì)合成，但關(guān)于AT2R的功能研究多在細(xì)胞培養(yǎng)及基因敲除水平，而在成年動(dòng)物病理狀態(tài)下，尤其是在新生內(nèi)膜形成過程中局部組織AT2R的功能及其與AT1R的相互作用關(guān)系研究領(lǐng)域尚屬空白。關(guān)于AT2R在在體水平究竟發(fā)揮怎樣的作用，是抑制還是促進(jìn)RS的發(fā)生，其詳盡作用機(jī)制又如何等問題均不明確，AT2R基因能否應(yīng)用于RS的治療也值得探討

5、。AngⅡ可刺激轉(zhuǎn)錄因子基本轉(zhuǎn)錄元件結(jié)合蛋白2(BTEB2)表達(dá)，促進(jìn)VSMC表型轉(zhuǎn)化及增殖，AT2R與之的作用關(guān)系亦不明確。 本研究以重組腺病毒為載體將大鼠AT2R基因轉(zhuǎn)移至原代培養(yǎng)的大鼠VSMC及大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷動(dòng)物模型中，觀察其在體內(nèi)外對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)基因及新生內(nèi)膜形成的影響，從AT2R與AT1R間的作用關(guān)系，AT2R對(duì)轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)因子受體表達(dá)的影響等角度深入研究AT2R介導(dǎo)新生內(nèi)膜形成抑制作用的分子機(jī)制，為RS的干預(yù)措

6、施研究提供理論依據(jù)和新的作用靶點(diǎn)。 研究方法：應(yīng)用高效的細(xì)菌內(nèi)同源重組方法成功構(gòu)建含有綠色熒光蛋白報(bào)告基因的重組腺病毒載體pAdCMV/AT2R，經(jīng)293細(xì)胞擴(kuò)增，純化獲得高滴度重組腺病毒；體外實(shí)驗(yàn)：膠原酶消化法培養(yǎng)原代大鼠VSMC，腺病毒pAdCMV/AT2R轉(zhuǎn)染VSMC后，用RT-PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡、免疫熒光雙標(biāo)、激光共聚焦等技術(shù)檢測(cè)分析AT2R在VSMC中的表達(dá)以及AT2R對(duì)VSMC增殖相關(guān)基因(AT1R、ERK1、E

7、RK2、BTEB2、PCNA)的mRNA及蛋白表達(dá)影響。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：建立大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷動(dòng)物模型，用pAdCMV/AT2R轉(zhuǎn)染損傷后的大鼠頸動(dòng)脈，7天～21天后進(jìn)行病理切片，檢測(cè)AT2R對(duì)新生內(nèi)膜增生的影響；采用RT-PCR、免疫組織化學(xué)、免疫熒光雙標(biāo)、激光共聚焦等技術(shù)檢測(cè)AT2R在新生內(nèi)膜中的表達(dá)以及增殖相關(guān)基因AT1R、ERK1、ERK2、BTEB2、PCNA、PDGFR-β、TGF-βⅠR的mRNA和蛋白質(zhì)在血管中表達(dá)變化。

8、 研究結(jié)果：①成功構(gòu)建重組腺病毒載體pAdCMV/AT2R，經(jīng)293細(xì)胞大量擴(kuò)增，獲得病毒滴度約1.5×1012pfu/ml。②VSMC轉(zhuǎn)染重組腺病毒pAdCMV/AT2R后12小時(shí)至3天均可檢測(cè)到AT2RmRNA及蛋白的表達(dá)，表明AT2R的表達(dá)比較穩(wěn)定。③免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)pAdCMV/AT2R轉(zhuǎn)染VSMC后，在AT2R表達(dá)陽性的細(xì)胞其增殖相關(guān)基因PCNA的蛋白表達(dá)陰性，pAdCMV/AT2R轉(zhuǎn)染組PCNA的表達(dá)顯著低于對(duì)照pAd

9、-GFP組，表明AT2R對(duì)VSMC增殖有明顯的抑制作用。④pAdCMV/AT2R組VSMC胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK1、ERK2、BTEB2mRNA及蛋白水平的表達(dá)顯著低于未轉(zhuǎn)染組和pAd-GFP組(p＜0.01)，而各組AT1R表達(dá)水平無顯著差異(p＞0.05)。⑤球囊損傷頸動(dòng)脈后7天新生內(nèi)膜開始形成，14天以后新生內(nèi)膜明顯向管腔內(nèi)增生造成明顯的管腔狹窄；重組腺病毒對(duì)損傷動(dòng)脈的轉(zhuǎn)染效率約40％；損傷后21天，與未轉(zhuǎn)染組和pAd-GFP組相

10、比，pAdCMV/AT2R組的I/M顯著降低(0.78±0.06vs1.44±0.22,1.36±0.21，p＜0.01)。⑥免疫組織化學(xué)及免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在各時(shí)相點(diǎn)pAdCMV/AT2R組PCNA陽性表達(dá)率均顯著低于未轉(zhuǎn)染組和pAd-GFP組(p＜0.01)，在AT2R表達(dá)陽性的部位PCNA表達(dá)陰性。⑦在正常大鼠動(dòng)脈未檢測(cè)到AT2R的表達(dá)；球囊損傷后AT2R在新生內(nèi)膜少量表達(dá)，pAdCMV/AT2R轉(zhuǎn)染組AT2R的表達(dá)水平顯著高

11、于未轉(zhuǎn)染組和pAd-GFP組(p＜0.01)，21天時(shí)仍維持較強(qiáng)表達(dá)。⑧pAdCMV/AT2R轉(zhuǎn)染組頸動(dòng)脈ERK1、ERK2、BTEB2、PDGFR-β、TGF-βⅠR的mRNA及蛋白水平的表達(dá)顯著低于未轉(zhuǎn)染組和pAd-GFP組(p＜0.01)，表達(dá)峰值變化在時(shí)間上存在著差別，ERK1、ERK2、BTEB2表達(dá)的峰值變化在術(shù)后7天，而PDGFR-β、TGF-βⅠR的表達(dá)峰值變化在術(shù)后14天，而各組頸動(dòng)脈AT1R表達(dá)水平無顯著差異(p＞0

12、.05)。 研究結(jié)論：①本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的重組腺病毒載體pAdCMV/AT2R可介導(dǎo)AT2R在原代培養(yǎng)VSMC及球囊損傷后大鼠頸動(dòng)脈中的表達(dá)；②AT2R基因轉(zhuǎn)染可抑制球囊損傷引起的大鼠頸動(dòng)脈新生內(nèi)膜增生；③AT2R基因轉(zhuǎn)染表達(dá)并發(fā)揮其生物學(xué)作用時(shí)，AT1R和AT2R之間不存在表達(dá)量上此起彼伏的關(guān)系，是建立在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基礎(chǔ)上的功能調(diào)節(jié)關(guān)系；④AT2R抑制AT1R的胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK1、ERK2激活，下調(diào)BTEB2、PCNA、PDGFR