腺病毒介導(dǎo)BTEB2反義RNA抑制大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后新生內(nèi)膜增生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的:經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)已成為目前治療冠心病的重要手段,但無(wú)論是經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)(PTCA)還是支架植入術(shù)都存在術(shù)后冠脈再狹窄(RS)的問(wèn)題.RS的發(fā)生機(jī)制尚未完全明確,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究資料表明,新生內(nèi)膜增生是各種PCI術(shù)后RS的共同特征.內(nèi)皮損傷后,在多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的作用下,中膜血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生表型轉(zhuǎn)化和增殖(損傷后1天)并向內(nèi)膜遷移(4~7天),內(nèi)膜VSMC進(jìn)一步增殖導(dǎo)致

2、新生內(nèi)膜形成及增生.因此,VSMC增殖是RS的主要病理機(jī)制的觀點(diǎn)目前已得到公認(rèn).基本轉(zhuǎn)錄元件結(jié)合蛋白2(BTEB2)是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子,它與基因啟動(dòng)子中GC序列結(jié)合,從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá).BTEB2在胚胎期動(dòng)脈及內(nèi)皮損傷動(dòng)脈中去分化的VSMC中高效表達(dá),在成年動(dòng)脈及正常VSMC中無(wú)表達(dá).生長(zhǎng)剌激(生長(zhǎng)因子、佛波酯、AngII等)可誘導(dǎo)其在VSMC中大量表達(dá).現(xiàn)有的文獻(xiàn)提示BTEB2可能在VSMC的增殖的過(guò)程中起重要作用,它可激活增殖相關(guān)基

3、因(PDGF、CDK4、TGF-β、c-jun),并參與VSMC表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控.因此,以BTEB2為目標(biāo)的干預(yù)性研究可能為再狹窄防治開(kāi)辟新的途徑.該研究擬通過(guò)腺病毒介導(dǎo)BTEB2反義RNA在培養(yǎng)VSMC中表達(dá),抑制BTEB2蛋白表達(dá),了解BTEB2反義RNA對(duì)體外培養(yǎng)VSMC增殖及其相關(guān)基因表達(dá)的影響;用反義BTEB2腺病毒載體轉(zhuǎn)染球囊損傷后的大鼠頸動(dòng)脈,于在體水平探討B(tài)TEB2反義RNA對(duì)VSMC增殖及新生內(nèi)膜增生的影響.研究方法:采

4、用Ⅰ型膠原酶消化法進(jìn)行大鼠主動(dòng)脈VSMC原代培養(yǎng);從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VSMC原代大鼠VSMC提取總RNA,用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到BTEB2 cDNA片段;采用位置特異性重組方法構(gòu)建攜帶大鼠反義BTEB2基因的腺病毒載體Ad.ASBTEB2,通過(guò)293細(xì)胞擴(kuò)增,純化制取高滴度重組腺病毒.Ad.ASBTEB2轉(zhuǎn)染培養(yǎng)VSMC后,用RT-PCR檢測(cè)BTEB2反義RNA的表達(dá);以蛋白質(zhì)免疫印跡、免疫細(xì)胞化學(xué)及RT-PCR等技術(shù)檢測(cè)分析BTEB2

5、反義RNA對(duì)BTEB2、VSMC增殖相關(guān)基因(PCNA、AT1R、PDGF-BB)和表型標(biāo)志基因(SMαA和Smemb)的蛋白及其mRNA表達(dá)的影響;用四唑鹽(MTT)比色試驗(yàn)及流式細(xì)胞儀等方法檢測(cè)BTEB2反義RNA對(duì)血清誘導(dǎo)的VSMV增殖的影響.建立大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型,用Ad.ASBTEB2轉(zhuǎn)染球囊損傷后的大鼠頸動(dòng)脈,1~3周后進(jìn)行病理切片,檢測(cè)BTEB2反義RNA對(duì)新生內(nèi)膜增生的影響;采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)BTEB2在新生內(nèi)膜中

6、的表達(dá);用伊文氏藍(lán)染色檢測(cè)BTEB2反義RNA對(duì)損傷動(dòng)脈內(nèi)皮修復(fù)的影響.研究結(jié)果:①用位置特異性重組技術(shù)成功構(gòu)建了攜帶攜帶大鼠反義BTEB2基因的腺病毒載體Ad.ASBTEB2,其滴度約5×1010pfu/ml;②在VSMC轉(zhuǎn)染重組腺病毒Ad.ASBTEB2后各時(shí)相點(diǎn),經(jīng)RT-PCR均可檢測(cè)到BTEB2反義RNA的表達(dá);③與未轉(zhuǎn)染組和Ad.LacZ組比較,Ad.ASBTEB2組各時(shí)相點(diǎn)的mRNA和蛋白表達(dá)明顯減少(p<0.01);④MT

7、T試驗(yàn)顯示,在不同MOI組Ad.ASBTEB2組吸光度值均較未轉(zhuǎn)染組和Ad.LacZ組顯著降低(p<0.01),而且吸光度值降低的趨勢(shì)隨著MOI的增加而更加明顯;⑤通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)VSMC增殖周期發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染Ad.ASBTEB2后可顯著增加G0/G1期細(xì)胞(p<0.01)及減少S期和G2/M期細(xì)胞比例(p<0.01).⑥免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染Ad.ASBTEB2可顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖相關(guān)基因PCNA、AT1R、PD

8、GF-BB的蛋白表達(dá);⑦免疫細(xì)胞化學(xué)及RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Ad.ASBTEB2轉(zhuǎn)染顯著抑制VSMC去分化型標(biāo)志基因Smemb蛋白及mRNA表達(dá)(p<0.01),并逆轉(zhuǎn)血清誘導(dǎo)的分化型標(biāo)志基因SMαA蛋白及mRNA的表達(dá)下調(diào)(p<0.01);⑧球囊損傷頸動(dòng)脈內(nèi)膜被伊文氏藍(lán)染成明顯的深藍(lán)色,表明內(nèi)皮損傷效果明顯;損傷后1周新生內(nèi)膜開(kāi)始形成,2周以后新生內(nèi)膜明顯向管腔內(nèi)增生造成明顯的管腔狹窄;⑨在正常動(dòng)脈VSMC中,通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)未見(jiàn)

9、到BTEB2的表達(dá);未轉(zhuǎn)染組和Ad.LacZ組在球囊損傷后7和14天可檢測(cè)到明顯的BTEB2表達(dá),損傷后21天BTEB2表達(dá)明顯減少;在各時(shí)相點(diǎn)Ad.ASBTEB2組BTEB2表達(dá)均顯著低于未轉(zhuǎn)染組和Ad.LacZ組(p<0.01);⑩重組腺病毒對(duì)損傷動(dòng)脈中層VSMC的轉(zhuǎn)染效率約12﹪~30﹪;損傷后3周,與未轉(zhuǎn)染組和Ad.LacZ組相比,Ad.ASBTEB2組的I/M明顯降低(0.77±0.07 vs 1.63±0.36,1.81±0