AT2R基因轉(zhuǎn)染對(duì)經(jīng)球囊損傷的大鼠頸動(dòng)脈體外培養(yǎng)后新生內(nèi)膜增生影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的：經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)廣泛應(yīng)用于缺血性心臟病，但術(shù)后再狹窄(RS)仍是影響其遠(yuǎn)期療效的最主要因素。目前PCI術(shù)后RS的機(jī)制尚不十分清楚，普遍認(rèn)為是多因素、多種機(jī)制共同參與的過(guò)程。其中動(dòng)脈血管的彈性回縮、血栓形成、血管壁重塑以及血管壁中層VSMC的過(guò)度增殖和遷移被認(rèn)為是促使PCI術(shù)后RS發(fā)展的主要因素。腎素血管緊張素系統(tǒng)參與了球囊損傷后再狹窄的形成。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)介導(dǎo)的生物學(xué)作用是重要的因素之一，其作用是通過(guò)

2、VSMC細(xì)胞膜的受體(ATR)介導(dǎo)完成的。ATR有四種亞型，以AT1R和AT2R為主，存在于動(dòng)物和人類的組織中。國(guó)內(nèi)外大量研究資料表明：AngⅡ的促進(jìn)新生內(nèi)膜形成的作用主要是AT1R介導(dǎo)的，AT2R則與AT1R的作用相拮抗。 本實(shí)驗(yàn)室已有研究結(jié)果證實(shí)：(1)VSMC轉(zhuǎn)染表達(dá)AT2R后，AT2R表達(dá)可明顯抑制VSMC的增殖與遷移。AngⅡ刺激可增強(qiáng)AT2R所產(chǎn)生的抑制VSMC增殖和遷移的作用，但其增強(qiáng)作用對(duì)AngⅡ無(wú)顯著濃度依賴性

3、。(2)VSMC轉(zhuǎn)染表達(dá)AT2R后，AT2R表達(dá)可明顯促進(jìn)VSMC發(fā)生凋亡，AT2R的致凋亡作用與AngⅡ無(wú)明顯關(guān)系。AT2R所介導(dǎo)的抑制VSMC增殖、遷移并促進(jìn)其凋亡作用有利于減少血管損傷后新生內(nèi)膜形成。 但以前的研究均局限于細(xì)胞水平。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步了解AT2R基因轉(zhuǎn)染經(jīng)球囊損傷的大鼠頸動(dòng)脈并觀察體外培養(yǎng)后對(duì)新生內(nèi)膜增生的影響，有助于探討AT2R基因轉(zhuǎn)染在RS防治中的可行性及潛在意義，為在體實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法

4、：(1)采用先進(jìn)的腺病毒AdEasy系統(tǒng)，應(yīng)用細(xì)菌內(nèi)同源重組方法構(gòu)建重組腺病毒，將穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV/AT2R酶切線性化再轉(zhuǎn)化含有超螺旋腺病毒核心基因組的AdEasier-1細(xì)菌，卡那霉素抗性選擇轉(zhuǎn)化重組子重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-1/AT2R，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，從而獲得含AT2R基因的腺病毒載體pAdCMV/AT2R。 (2)采用含30％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液以及使用95％O2和5％CO2的氣體環(huán)

5、境進(jìn)行動(dòng)脈血管的器官培養(yǎng)。利用光鏡、電鏡、共聚焦顯微鏡相結(jié)合綜合評(píng)定動(dòng)脈血管器官培養(yǎng)14天時(shí)的生存狀況。 (3)將構(gòu)建的AT2R重組腺病毒轉(zhuǎn)染經(jīng)球囊損傷的大鼠頸動(dòng)脈，并進(jìn)行體外培養(yǎng)。 (4)應(yīng)用RT-PCR、免疫組化、蛋白免疫印跡檢測(cè)AT2R的表達(dá)。 (5)TUNEL法檢測(cè)血管組織中凋亡細(xì)胞的變化情況。 結(jié)果：(1)成功構(gòu)建了重組腺病毒載體pAdCMV/AT2R。構(gòu)建的pAdCMV/AT2R用293細(xì)胞大

6、量擴(kuò)增，收集并純化，獲得的病毒滴度約1.5×1012pfu/ml。 (2)采用含30％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液以及使用95％O2和5％CO2的氣體環(huán)境進(jìn)行大鼠頸動(dòng)脈體外培養(yǎng)14天，經(jīng)光鏡、電鏡、共聚焦顯微鏡相結(jié)合綜合評(píng)價(jià)，動(dòng)脈血管環(huán)培養(yǎng)14仍然存活。 (3)經(jīng)球囊損傷的大鼠經(jīng)動(dòng)脈在體外培養(yǎng)14天，有新生內(nèi)膜增生。 (4)重組腺病毒轉(zhuǎn)染經(jīng)球囊損傷的大鼠頸動(dòng)脈后，體外培養(yǎng)3天在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光，表明轉(zhuǎn)染成功

7、。 (5)損傷的大鼠頸動(dòng)脈體外培養(yǎng)1周，三組動(dòng)脈內(nèi)膜增生無(wú)顯著差異；培養(yǎng)2周，與未轉(zhuǎn)染組和PAd-GFP組相比，PAdCMV/AT2R組的內(nèi)膜/中膜面積比分別降低了約20％、17％，表明腺病毒介導(dǎo)的AT2R基因轉(zhuǎn)染可明顯抑制大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷后的新生內(nèi)膜增生。 (6)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染3天后，在轉(zhuǎn)染組血管檢測(cè)到AT2RmRNA的表達(dá)而對(duì)照病毒組及未轉(zhuǎn)染組未檢測(cè)到AT2RmRNA。AT2R免疫印跡結(jié)果也進(jìn)一步

8、證實(shí)，在轉(zhuǎn)染3天后，PAdCMV/AT2R組開始有AT2R蛋白表達(dá)，7天、14天后表達(dá)水平持續(xù)升高。PAd-GFP組和未轉(zhuǎn)染組均無(wú)AT2R的蛋白表達(dá)。免疫組織化學(xué)在各時(shí)相點(diǎn)PAdCMV/AT2R組均有AT2R陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，而未轉(zhuǎn)染組和PAd-GFP組未見AT2R陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。 (7)體外培養(yǎng)的血管有少量的凋亡現(xiàn)象，但轉(zhuǎn)染AT2R后，血管的新生內(nèi)膜及中膜的細(xì)胞凋亡顯著增多。 結(jié)論：(1)本研究建立了體外動(dòng)脈器官培養(yǎng)的模型，