利用DNA-Barcoding技術(shù)鑒別動物源性成分.pdf

1、隨著生活質(zhì)量水平的提高，肉制品生產(chǎn)量達到了人類歷史上前所未有的數(shù)量。肉制品的摻雜、摻假行為，動物疫病蔓延，宗教對肉制品的禁忌以及珍稀動物保護等問題，已受到當前社會熱切關(guān)注。利甩PCR技術(shù)鑒別動物源性成分來源是打擊違法違規(guī)行為的科學依據(jù)，同時也是保護珍稀動物的有力保障。本文通過遺傳生物學方法，力爭鑒別動物源性成分來源于不同物種間和在不同品種間。同時也利用PCR技術(shù)精確快速的特性，來對動物源性成分及含量進行定性分析和定量檢測。
　　本

2、實驗的研究分為三部分:(1)基于國際生命條碼聯(lián)盟(CBOL，the Consortiumfor the Barcode of Life)提出的Barcoding技術(shù)所確定的序列區(qū)域。通過NCBI查詢和Oligo6.0和Primer5.0軟件的篩選，得到了COⅠ基因的通用引物，可以擴增牛、羊、豬、家禽、家兔、犬和貓七個物種的COⅠ基因片段。然后使用Vector NTI.11.5軟件，篩選了AfaⅠ做為本試驗的限制性內(nèi)切酶。結(jié)果顯示，牛、羊

3、、豬、家禽、家兔、犬和貓七個物種能被AfaⅠ限制性內(nèi)切酶切成不同片段，從而鑒別出不同物種的動物源性成分。(2)根據(jù)mtDNA中COⅠ基因序列的保守性和適度進化特性，設計了Realtime-PCR的熔解曲線法，檢測豬源性成分的來源，即加快了檢測的速度，也增加了同時檢測樣品的數(shù)量。同時，為了避免食品中PCR抑制劑的影響，本試驗設置GCG基因125bp的純化片段為內(nèi)參照，控制假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。通過優(yōu)化PCR反應條件，豬和GCG基因的特異性產(chǎn)物

4、分別在79.2℃和75℃有特異性熔解峰。設置牛、羊、家禽、家兔、鼠和空白對照，均無特異性擴增。測序結(jié)果表明，該豬特異性引物的PCR產(chǎn)物長度為245bp，其核酸序列與NCBI中相應序列吻合。0.001％為該方法的LOV值。(3)利用功能性蛋白基因在不同品種間的差異來鑒別動物源性成分的來源。首先，我們要選擇遺傳高度保守性遺傳的品種，本實驗選擇了五指山豬(WZSP)和杜洛克豬作為鑒別對象，通過文獻了解到WZSP和普通體型豬在GHR基因上有多個

5、SNP位點，其中有兩個SNP位點是有意突變，且改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象，影響了生長激素的作用。豬的GHR基因序列是根據(jù)NCBI上SusCrafa物種查詢得到的，根據(jù)已報道的引物。擴增WZSP和杜洛克豬的GHR基因得到序列產(chǎn)物，再根據(jù)信息利用Vector NTI.11.5軟件篩選內(nèi)切酶PstⅠ。實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過內(nèi)切酶PstⅠ消化酶切后WZSP的GHR基因擴增產(chǎn)物的序列會出現(xiàn)2條帶，而普通體型豬杜洛克則出現(xiàn)一條帶，說明該方法成功的鑒別出了動物源

6、性成分在不同品種間的來源。通過混合檢測，該方法的檢出限(LOD)為5％。LOD值較高的原因可能是功能性蛋白基因與線粒體基因相比，在單個細胞內(nèi)基因數(shù)量上要少很多，且GHR基因序列較長，容易降解斷裂。
　　該實驗的目的主要是為了利用DNA-Barcoding技術(shù)建立同時鑒別不同物種源性成分以及批量檢測豬源性成分的方法。然后在鑒別物種的基礎上，利用GHR基因的SNPs位點來鑒別品種五指山豬源性的成分。同時也為鑒定機構(gòu)制定檢測標準奠定基礎