利用催化發(fā)夾組裝的生物傳感器檢測(cè)目標(biāo)DNA和人源性α-凝血酶.pdf

1、目的：
　　腫瘤相關(guān)DNA存在于患者的血液、唾液、尿液和其他分泌液中，與正常DNA相比，其往往會(huì)發(fā)生堿基突變，而檢測(cè)目標(biāo)DNA的堿基突變有助于腫瘤的篩查和腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的檢測(cè)。由于腫瘤早期體液中的腫瘤DNA表達(dá)量很少，因此，尋找一種靈敏、特異的識(shí)別方法用于檢測(cè)目標(biāo)DNA的濃度對(duì)早期診斷腫瘤有著非常重要的意義。
　　α-凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶，它主要參與血液凝血過程，有促凝和抗凝的雙重作用，其在體內(nèi)的異常表達(dá)與血栓性疾病的發(fā)生

2、直接相關(guān)。然而，目前用于α-凝血酶的檢測(cè)方法卻存在操作繁瑣、試劑價(jià)格昂貴、不夠靈敏等問題。
　　本研究利用串聯(lián)的分支整合DNA耦合催化發(fā)夾組裝反應(yīng)（CHA）制成的生物傳感器可直接檢測(cè)目標(biāo)DNA以及人源性α-凝血酶，同時(shí)，對(duì)傳感器的可行性、靈敏度和特異性進(jìn)行了分析。
　　方法：
　　1．串聯(lián)體分支整合DNA的形成：目標(biāo)物分子存在的條件下，打開第一條DNA發(fā)夾H1，H1暴露出能打開發(fā)夾H2的序列并打開發(fā)夾H2，H2暴露出的

3、序列打開發(fā)夾H1進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)，最終形成一系列串聯(lián)體分支整合DNA。當(dāng)缺乏目標(biāo)物時(shí)，2種發(fā)夾DNA獨(dú)立存在于同一體系中，相互之間不發(fā)生反應(yīng)。
　　2．CHA反應(yīng)：串聯(lián)體分支整合DNA上含有自由的緊密靠近的觸發(fā)鏈，可觸發(fā)C HA的發(fā)生。由于一個(gè)目標(biāo)物分子可引發(fā)一條串聯(lián)分支整合DNA鏈形成，而一條分支整合DNA鏈含有多個(gè)觸發(fā)鏈，從而觸發(fā)多個(gè)C HA反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)第一次信號(hào)放大。
　　3．類過氧化物酶催化底物反應(yīng)和信號(hào)進(jìn)一步放大：CH

4、A發(fā)生后，每一條雙鏈 DNA產(chǎn)物末端都含有 G-四聚體結(jié)構(gòu)，當(dāng)加入血紅素后，G-四聚體被激活并具有類過氧化物酶的活性。在過氧化氫存在下，其催化ABTS發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而在418 nm處形成特征性吸收峰。
　　4．可行性分析：利用非變形聚丙烯酰胺凝膠電泳和紫外可見分光光度計(jì)表征可行性。
　　5．傳感器檢測(cè)的條件優(yōu)化及性能評(píng)價(jià)：對(duì) H1與目標(biāo)DNA之間互補(bǔ)堿基的長(zhǎng)度、H2與H3濃度、CHA的孵育時(shí)間和孵育溫度進(jìn)行優(yōu)化；對(duì)傳感

5、器的靈敏度、特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果：
　　1．非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果表明，分步的串聯(lián)體分支整合DNA反應(yīng)以及 CHA反應(yīng)可行。紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)一步證明目標(biāo)物分子引發(fā)串聯(lián)體分支整合DNA反應(yīng)，進(jìn)而由串聯(lián)體上的引發(fā)物鏈引發(fā)CHA的一體化反應(yīng)可行。
　　2．目標(biāo)物分子加入后觸發(fā)信號(hào)放大反應(yīng)體系，產(chǎn)生的具有類過氧化物酶活性的G-四聚體DNAzyme催化底物并在418 nm處產(chǎn)生特征性吸收峰，根據(jù)吸收峰強(qiáng)度隨濃度的

6、變化制定了標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　3．基于串聯(lián)體分支整合 DNA及 CHA的傳感器性能：檢測(cè)目標(biāo)DNA分子的線性范圍是1.0 pM到75 nM，檢測(cè)下限為0.14 pM（S/N=3）；檢測(cè)人源性α-凝血酶的線性范圍是1.0 pM到2.5 nM,檢測(cè)下限為0.68 pM（S/N=3）；具有單堿基突變識(shí)別能力。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)研究利用串聯(lián)體分支整合DNA及CHA構(gòu)建了一種新的生物傳感器檢測(cè)目標(biāo)DNA分子以及人源性α-凝血酶