可可粉中幾種外源植物源性成分PCR檢測技術(shù)的研究.pdf

1、可可粉是由可可豆直接加工制成的深加工食品，營養(yǎng)豐富，它是制作巧克力的重要原料，可可飲料也是當(dāng)今世界3大嗜好性飲料之一。國內(nèi)市場可可粉售價(jià)高，假冒偽劣現(xiàn)象充斥交易市場，主要摻假成分有大豆粕、芝麻粕、花生殼和板栗殼等植物下腳料，而現(xiàn)有的可可粉及可可制品檢驗(yàn)檢測標(biāo)準(zhǔn)只是對脂含量、蛋白含量等的檢測，不能判斷可可粉中有無外源植物源性成分的摻假。論文以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，建立了從可可粉中檢測大豆、芝麻、花生、板栗源性成分的快速鑒定技術(shù)。 論文

2、比較了2種改良CTAB法和SDS法在提取可可粉DNA中的作用。顯示3種方法提取材料總DNA的產(chǎn)量均較高，在純度上2種CTAB法相差不大，但SDS法稍低；在以高等植物18SrDNA為內(nèi)參照基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，2種CTAB法提取的材料DNA均能擴(kuò)增出內(nèi)參照基因片段，而SDS提取的組別有部分出現(xiàn)不能擴(kuò)增出的現(xiàn)象。2種CTAB法均可用于可可粉材料DNA的提取。 論文針對GenBank公布的大豆kti-S、芝麻oleosin、花生2Sp

3、rotein及板栗leafy-like等基因，利用引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)引物。分別以大豆粕、芝麻粕、花生殼及板栗殼DNA為模板，以相應(yīng)基因組DNA為陽性對照，可可基因組DNA為陰性對照，通過PCR擴(kuò)增篩選特異的檢測引物。確定的各材料特異性引物對分別為：大豆，5'-GAAACGGCGGCACATACT-3'，5'-GGCAGACCCTTGAGAATA-3'；芝麻，5'-CCTTCCTTGGCTGTGCTCTTA-

4、3'，5'-TTCGTCGCTTTCTTGGGTTC-3'；花生，5'-TAAGGCAAAGCK3TGGAGC-3'，5'-GCAGTTCTGGGGCAAGTT-3'：板栗，5'-TAGGTTTGCGAAGAAGGC-3'，5'-CGGATAGACGGGGATGT-3'。目的片段大小分別為266bp、153bp、267bp和167bp。 以上述序列為引物對擴(kuò)增目的DNA片段，PCR反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液5μL，MgCl2(

5、25mmol/L)4μL，dNTPs(5mmol/L)4μL，上、下游引物(10μmol/L)各2μL，Ex-Taq酶(5U/μL)0.3μL，模板DNA2μL(100ng～200ng)，加滅菌雙蒸水至50μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5min；隨后94℃，50s→Ta(各引物對的相應(yīng)退火溫度)，1min→72℃，45s，43個(gè)循環(huán)：最后于72℃延伸8min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，如有目的條帶出現(xiàn)則說明有相應(yīng)的物質(zhì)摻假