鵝T細(xì)胞表面分子CD8α的分子克隆及其免疫學(xué)活性研究.pdf

1、CD8是一種淋巴細(xì)胞表面糖蛋白，主要參與并介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。本研究首次克隆并報(bào)道了鵝CD8α的全部cDNA序列，鵝CD8α由1459 bp堿基構(gòu)成，包含711bp的編碼區(qū)。對(duì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析的結(jié)果顯示:CD8α在禽類中較保守，尤其是鵝與番鴨、麻鴨的堿基相似度達(dá)90％以上，氨基酸相似度約為80％。根據(jù)CD8α氨基酸序列構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果也證實(shí)，鵝CD8α與番鴨、麻鴨一起構(gòu)成區(qū)別于雞的單獨(dú)分支。
　　我們用半定量RT-PCR檢

2、測(cè)了CD8α在雛鵝組織分布情況。同時(shí)，選用β-actin作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正檢測(cè)。結(jié)果顯示:CD8α在免疫相關(guān)組織（包括胸腺、脾臟和法氏囊）和粘膜相關(guān)組織（比如皮膚）的轉(zhuǎn)錄量相對(duì)最高;此外，CD8α在腦組織中轉(zhuǎn)錄量也較高。對(duì)比雛鵝與成年鵝免疫相關(guān)組織CD8α轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果顯示:CD8α在雛鵝與成年鵝的胸腺與脾臟轉(zhuǎn)錄量均相對(duì)最高;雛鵝法氏囊組織中CD8α的轉(zhuǎn)錄量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于成年鵝法氏囊組織中CD8α的轉(zhuǎn)錄量;而在小腸與盲腸中，雛鵝中CD8α的

3、轉(zhuǎn)錄量低于成年鵝中CD8α的轉(zhuǎn)錄量。此研究為揭示免疫器官的發(fā)育有重要參考價(jià)值。應(yīng)用半定量RT-PCR方法對(duì)雛鵝新型病毒性腸炎病毒引發(fā)的急性與慢性感染模型中CD8α在免疫相關(guān)組織的分布進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示:在感染后CD8α在各個(gè)免疫相關(guān)組織的轉(zhuǎn)錄水平都有升高。此感染模型的建立為研究鵝免疫器官的免疫應(yīng)答狀況奠定了基礎(chǔ)。
　　以鵝脾臟淋巴細(xì)胞為模型檢測(cè)了鵝CD8α的免疫學(xué)活性。本研究先后選用的免疫刺激劑包括:植物血球凝集素(phytoh

4、emagglutinin，PHA)、伴刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)、聚肌胞(polyriboinosinic polyribocytidylic acid，Poly I∶C)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等，將其與體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行共孵育，分別于24 h、48 h、72 h和96 h采樣，再以實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitive PCR)方法檢測(cè)CD8α轉(zhuǎn)錄水平的

5、變化。結(jié)果顯示:免疫刺激劑PHA、ConA和Poly I∶C可以顯著性上調(diào)CD8α的轉(zhuǎn)錄量;LPS對(duì)CD8α的轉(zhuǎn)錄沒(méi)有任何影響。本研究結(jié)果證實(shí)鵝CD8a與雞、鴨CD8α分子有相似的免疫學(xué)活性。
　　建立病毒感染的體外模型，即分別選用小鵝瘟病毒與雛鵝病毒性腸炎病毒感染鵝脾臟淋巴細(xì)胞，檢測(cè)病毒對(duì)鵝CD8α分子的誘導(dǎo)表達(dá)情況，同時(shí)用PBS、PHA處理的脾臟淋巴細(xì)胞分別作為陰性與陽(yáng)性對(duì)照組。免疫熒光染色方法檢測(cè)結(jié)果顯示:感染NGVEV48

6、 h和GPV感染72 h時(shí)，鵝CD8α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)顯著性增加。利用建立的體外感染模型，本研究初步探索了鵝細(xì)胞水平的抗病毒免疫應(yīng)答情況，分別檢測(cè)了鵝T細(xì)胞表面分子（CD8α和CD4）和抗病毒相關(guān)分子（IFN-a、IFN-γ和IL-18）轉(zhuǎn)錄水平的變化。real-time qPCR的結(jié)果顯示:CD8α、CD4、IFN-a和IFN-γ在NGVEV感染后的48 h、72 h和96 h轉(zhuǎn)錄水平均有顯著性升高(P＜0.05); IL-18的轉(zhuǎn)錄

7、在感染后48 h和96 h呈現(xiàn)顯著性升高(P＜0.05)。在GPV感染模型中，real-timeqPCR檢測(cè)到IFN-a、IFN-γ和IL-18的轉(zhuǎn)錄量從感染的24 h呈現(xiàn)顯著性增高(P＜0.05); CD4 mRNA水平在感染后的48 h和72 h有顯著性上調(diào);CD8α的轉(zhuǎn)錄量在感染后48 h、72 h和96 h有顯著性上調(diào)(P＜0.05)。real-time qPCR檢測(cè)GPV在脾臟淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平變化的結(jié)果顯示:細(xì)胞感染病毒24

8、 h時(shí)，GPV的轉(zhuǎn)錄量有了成千倍的上升;但在感染后的48 h和72 h時(shí)，病毒轉(zhuǎn)錄量下降到一個(gè)較低的狀態(tài)，在感染后的96 h時(shí)，GPV的含量陡增到上萬(wàn)倍的變化。感染過(guò)程中細(xì)胞增殖與活性檢測(cè)的結(jié)果顯示:無(wú)論在NGVEV還是GPV感染過(guò)程中，試驗(yàn)組脾臟淋巴細(xì)胞的活性與PBS對(duì)照組相比都沒(méi)有顯著性變化。此結(jié)果說(shuō)明:病毒刺激引起的免疫分子表達(dá)量的增加并非是由于T細(xì)胞數(shù)量增加所致，而是誘導(dǎo)單位細(xì)胞數(shù)量中免疫分子的表達(dá)量的增加。此研究為鵝免疫學(xué)活性