鵝TLR7和TLR21的分子克隆、生物信息學(xué)分析及其免疫學(xué)特性研究.pdf

1、Toll樣受體是機(jī)體內(nèi)一類(lèi)重要的病原識(shí)別受體，能對(duì)入侵機(jī)體的病原微生物進(jìn)行及時(shí)的識(shí)別，從而啟動(dòng)機(jī)體固有免疫應(yīng)答并影響適應(yīng)性免疫的產(chǎn)生。本研究首次克隆并報(bào)道了四川白鵝Toll樣受體家族的TLR7和TLR21的cDNA序列，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。鵝TLR7包含一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框，編碼1045個(gè)氨基酸，其信號(hào)肽位于第1到27位，跨膜區(qū)位于第836位到860位，高度保守TIR結(jié)構(gòu)域位于第884位到1034位。鵝TLR21包含一個(gè)完整的開(kāi)放閱

2、讀框，編碼975個(gè)氨基酸，其信號(hào)肽位于第1到35位，跨膜區(qū)位于第757位到779位，高度保守TIR結(jié)構(gòu)域位于第809位到951位。比較兩基因在不同物種之間蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)物種之間親緣關(guān)系越接近比對(duì)相似性越高。
　　為了得到TLR7和TLR21在鵝體各個(gè)組織的分布情況，我們利用半定量RT-PCR和定量RT-PCR方法構(gòu)建了組織表達(dá)譜。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，選擇β-actin和GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果校正檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn):

3、TLR7的轉(zhuǎn)錄水平在雛鵝的法氏囊上最高，且在與免疫功能相關(guān)的組織如盲腸，哈德氏腺等也相對(duì)較高。值得注意的是，肺臟的相對(duì)表達(dá)量?jī)H次于法氏囊，說(shuō)明鵝TLR7與呼吸道疾病或許有緊密聯(lián)系。比較不同年齡鵝之間免疫組織表達(dá)譜后，我們發(fā)現(xiàn)無(wú)論是成年鵝，還是幼鵝，都在法氏囊和脾臟有穩(wěn)定的高表達(dá)。不同的是，幼鵝以法氏囊，胸腺為主要免疫器官，而或許是隨著發(fā)育進(jìn)行，成年鵝則是以外周血，法氏囊和脾臟為主要免疫器官。TLR21的轉(zhuǎn)錄水平在鵝的哈德氏腺，胸腺等免疫

4、功能相關(guān)組織表達(dá)量高。比較不同年齡鵝之間全組織表達(dá)譜后，我們發(fā)現(xiàn)幼年鵝法氏囊表達(dá)最高，而成年鵝法氏囊卻只有中等的轉(zhuǎn)錄水平，這與TLR7的結(jié)果類(lèi)似，說(shuō)明鵝免疫分子的在組織中的表達(dá)量隨個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育而有所變化。總體來(lái)講，TLR7和TLR21都在免疫組織器官中高表達(dá)，這與它們發(fā)揮的免疫功能密切相關(guān)。不同發(fā)育階段鵝TLRs的組織表達(dá)差異，也說(shuō)明了鵝免疫系統(tǒng)隨著發(fā)育而成熟。
　　為了驗(yàn)證鵝TLR7和TLR21的免疫學(xué)特性，我們選取了幾種免疫刺

5、激劑:R848、Imiquimod、Poly(I∶C)和ODN2006。這些刺激劑都是已知證實(shí)能被Toll樣受體識(shí)別，并引發(fā)固有免疫反應(yīng)。其中R848是TLR7和TLR8的刺激劑，Imiquimod是TLR7的刺激劑，Poly(I∶C)是TLR3的刺激劑，而ODN2006則是TLR9和TLR21的刺激劑。通過(guò)這些刺激劑處理分離的鵝脾臟淋巴細(xì)胞和鵝外周血淋巴細(xì)胞，利用定量RT-PCR方法檢測(cè)TLR7和TLR21是否受刺激而表達(dá)上調(diào)，同時(shí)檢

6、測(cè)免疫通路下游的促炎性因子IL-6，IL-1β和干擾素IFN-α與IFN-γ的表達(dá)情況。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，選擇β-actin和GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果校正檢測(cè)，并同時(shí)以PBS處理鵝脾臟淋巴細(xì)胞和鵝外周血淋巴細(xì)胞做陰性對(duì)照。我們發(fā)現(xiàn):和預(yù)期一樣，R848和Imiquimod都能引起鵝TLR7的響應(yīng)，同時(shí)TLR7介導(dǎo)固有免疫通路下游的IL-6，IL-1β和IFN-α也都有顯著的表達(dá)上調(diào)。ODN2006能夠有效的刺激鵝TLR21的表達(dá)并

7、引發(fā)下游的IL-6，IL-1β，IFN-α和IFN-γ的顯著上調(diào)，而Poly(I∶C)作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)TLR7和TLR21表達(dá)量無(wú)影響，但是上調(diào)IL-6和IFN-α的表達(dá)，說(shuō)明或許是鵝TLR3被刺激產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。總體來(lái)說(shuō)，這些刺激劑都能有效地引起鵝脾臟淋巴細(xì)胞和鵝外周血淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)，因此有作為新型鵝疾病防治免疫佐劑的可能。
　　為了確認(rèn)鵝TLR7和TLR21參與宿主的抗病毒反應(yīng)，我們選用新型雛鵝病毒性腸炎病毒(NGVEV)

8、感染分離的鵝脾臟淋巴細(xì)胞和鵝外周血淋巴細(xì)胞，利用定量RT-PCR方法檢測(cè)TLR7和TLR21是否受刺激表達(dá)上調(diào)，同時(shí)檢測(cè)免疫通路下游的促炎性因子IL-6，IL-1β和干擾素IFN-α與IFN-γ的表達(dá)情況。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，選擇β-actin和GAPDH作為內(nèi)參基因?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果校正檢測(cè)，并同時(shí)以PBS處理鵝脾臟淋巴細(xì)胞和鵝外周血淋巴細(xì)胞做陰性對(duì)照。我們發(fā)現(xiàn):在NGVEV感染之后，鵝TLR7在96h內(nèi)均無(wú)表達(dá)上調(diào)，而鵝TLR21則能被刺激，并