鯉天然免疫識別受體 TLR1和TLR21的基因克隆及免疫功能的初步研究.pdf

1、Toll樣受體（TLRs）是重要的模式識別分子，是連接適應(yīng)性免疫和天然免疫的橋梁。TLRs受體可以分為六大亞家族，TLR1家族、TLR3家族、TLR4家族、TLR5家族、TLR7家族、TLR11家族。魚類是目前已知的TLRs種類最多的物種，目前已經(jīng)在魚類中發(fā)現(xiàn)21種TLRs。對魚類TLRs的研究可以為天然免疫的進化研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　本研究運用PCR技術(shù)和RACE技術(shù)首次從鯉中克隆得到TLR1和TLR21基因的全長。TLR1的

2、cDNA全長為2626 bp，開放閱讀框（ORF）為2166 bp，編碼721個氨基酸殘基， TLR21的cDNA全長為3604 bp，ORF包含2892 bp，編碼963個氨基酸殘基，利用SMART軟件對兩者的結(jié)構(gòu)域進行分析，發(fā)現(xiàn)其具有典型的TLRs受體結(jié)構(gòu)，包含了一個胞內(nèi)的TIR結(jié)構(gòu)域、一個跨膜區(qū)、一個胞外亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域。使用BioEdit軟件對不同物種的氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)胞外具有天冬酰胺位點，推測與馬蹄狀結(jié)構(gòu)形成有關(guān)，

3、胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域保守性較高。利用I-TASSER軟件在線模擬TLR1和TLR21的三維空間結(jié)構(gòu)，證實了兩者典型的TLRs受體家族特征。使用MEGA6軟件對不同魚類及部分哺乳動物構(gòu)建進化樹，發(fā)現(xiàn)鯉魚的TLR1屬于TLR1家族成員，與草魚的親緣關(guān)系最近，而TLR21屬于TLR11家族成員，與斑馬魚和大西洋鮭魚的親緣關(guān)系最近。利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測鯉TLR1和TLR21在肝臟、脾臟、頭腎、前腸、后腸、鰓、性腺、皮膚、肌肉、口腔上皮和腦

4、等11種組織中表達分布情況。結(jié)果顯示，TLR1在腦、脾臟、頭腎和性腺中表達較高，在后腸和口腔上皮細胞中表達較低，TLR21在脾臟和頭腎中表達較高，在皮膚和肝臟中表達較低。對鯉進行嗜水氣單胞菌注射刺激后，TLR1 mRNA的表達量在前腸、后腸和肝臟中有明顯升高的趨勢，其中在后腸和肝臟中升高為對照組的7倍，TLR21 mRNA的表達量在肝臟、前腸和后腸中有升高的趨勢。對鯉進行腹腔注射poly(I:C)，誘導(dǎo)了其肝臟、脾臟、頭腎、前腸和后腸中