鱖TLR9信號通路相關(guān)基因克隆和功能初步研究.pdf

1、鱖(Siniperca chuatsi)是我國重要的魚類養(yǎng)殖品種，而近年來傳染性脾腎壞死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus，ISKNV)病的暴發(fā)流行給鱖養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為了更好地防治魚類病毒性疾病，有必要對其免疫系統(tǒng)進(jìn)行深入的研究，以期找到更好的預(yù)防和治療的方法。TLRs(Toll—like receptors)作為重要的模式識別受體(pattern recognit

2、ion receptor，PRR)，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮非常重要的作用。它們通過識別病原體分子結(jié)構(gòu)中保守的病原相關(guān)的分子模型(Pathogen—associated molecular pattern，PAMP)，進(jìn)而引發(fā)宿主一系統(tǒng)的免疫反應(yīng)，構(gòu)成了機體抗感染的第一道防線，并對獲得性免疫的發(fā)生和類型起重要的調(diào)節(jié)作用。其中TLR9能識別未甲基化的CPG—ODN，而ISKNV做為DNA病毒，具有豐富的未甲基化的CPG—ODN島。因此鱖TLR9信

3、號通路相關(guān)基因的研究，可以為病毒與宿主的相互作用研究，及疫苗的研發(fā)提供較為理想的理論基礎(chǔ)。 作者利用簡并引物PCR和RACE技術(shù)，首次從鱖克隆到TLR9，MyD88，IRAK1，TRAF6，TAK1，TAB2，F(xiàn)ADD和Caspase8基因的cDNA全長，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，鱖TLR9(ScTLR9)的cDNA全長3799bp，編碼1083aa的蛋白，含有胞外15個富含亮氨酸重復(fù)序列(LRRs)，1個富含半胱氨酸的

4、C端亮氨酸富集區(qū)(LRRCT)，以及胞內(nèi)Toll/白介素1受體TIR；鱖MyD88(ScMyD88) cDNA全長1757bp，編碼289aa的蛋白，包括一個死亡結(jié)構(gòu)域DD，和一個保守的TIR結(jié)構(gòu)域；鱖IRAK1(ScIRAK1) cDNA全長2676 bp，編碼754aa的蛋白，包含一個死亡結(jié)構(gòu)域DD和一個絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域：鱖TRAF6(ScTRAF6) cDNA全長2292bp，編碼602aa的蛋白，包括一個N端的鋅指結(jié)構(gòu)域

5、和一個C端保守的MATH結(jié)構(gòu)域；鱖TAK1(ScTAK1) cDNA全長2552bp，編碼563aa的蛋白，包括一個N端絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域；鱖TAB2(ScTAB2) cDNA全長3412bp，編碼763aa的蛋白，包括N端CUE結(jié)構(gòu)域和C端鋅指結(jié)構(gòu)；鱖FADD(ScFADD) cDNA全長813bp，編碼193aa的蛋白，包括N端死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(DED)和C端死亡結(jié)構(gòu)域DD；鱖Caspase8(ScCaspase8)cDNA

6、全長1951bp，編碼447aa的蛋白，包括2個N端死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域DED，和一個C端CASc結(jié)構(gòu)域。通過以上工作，獲得了鱖TLR9信號通路所有基因的cDNA全長，為鱖先天性免疫的研究打下了基礎(chǔ)。 為了研究這些基因的表達(dá)及調(diào)控情況，作者用實時定量PCR技術(shù)，檢測了健康鱖及脂多糖、金黃葡萄球菌、溶藻弧菌、水霉和ISKNV注射后鱖各組織中這些基因的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示，這8個基因都能在鰓、頭腎、后腎、脾、血、肝、腸、心、胃、腦、

7、皮膚和肌肉中表達(dá)，大部分基因在免疫組織脾、鰓、頭腎、后腎以及血細(xì)胞中表達(dá)豐富，在肌肉、皮膚和肝中表達(dá)較少；在注射溶藻弧菌和水霉24h后，鱖脾臟中各基因的mRNA水平上調(diào)；在ISKNV感染4天后，鱖脾臟ScTLR9和ScMyD88的mRNA水平均上調(diào)：在ISKNV感染7天后，鱖ScIRAK1發(fā)病鱖的血細(xì)胞中發(fā)生顯著性上調(diào)，而在雖感染卻未發(fā)病的魚中未上調(diào)；同時，在ISKNV感染鱖仔魚細(xì)胞系48h后，ScTLR9的mRNA水平開始上調(diào)，在12

8、0h的時候達(dá)到最高。這些結(jié)果提示，在某些病原體感染后，可激活TLR9信號通路某些基因的表達(dá)，從而激活下游的一些抵抗病原體的效應(yīng)因子基因的表達(dá)，從而起到抵抗病原體的作用。 為了研究TLR9信號通路基因在激活NF—κB中的作用，作者構(gòu)建帶FLAG標(biāo)簽的各基因重組質(zhì)粒，與NF—κB螢光素酶和海腎螢光素酶報告載體一起轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過雙螢光素酶檢測來判斷NF—κB的激活情況。結(jié)果顯示，ScMyD88、ScIRAK1、ScTRAF6能

9、顯著上調(diào)NF—κB活性。 為研究ScFADD和ScCaspase8的功能，作者構(gòu)建帶FLAG標(biāo)簽的ScFADD和ScCaspase8重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞和FHM細(xì)胞，用免疫熒光顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，ScFADD和ScCaspase8的表達(dá)可明顯促進(jìn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡；同時，用PI和Hoechst雙染轉(zhuǎn)染24h后的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了典型的細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化；用流式細(xì)胞儀檢測其凋亡情況，發(fā)現(xiàn)ScFADD和ScCaspase8都能促進(jìn)