TLR9信號途徑在成牙本質(zhì)細胞中作用的研究.pdf

1、齲病是口腔常見病、多發(fā)病。當齲壞到達牙本質(zhì)后，致齲菌和/或其毒性產(chǎn)物可以通過牙本質(zhì)小管進入牙髓腔，導(dǎo)致牙髓炎癥。免疫反應(yīng)和第三期牙本質(zhì)是牙髓發(fā)揮防御和修復(fù)能力的主要方式。成牙本質(zhì)細胞由于具有長的細胞突起深入到牙本質(zhì)小管，是牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體最先接觸細菌微生物的細胞，那么成牙本質(zhì)細胞是否和口腔粘膜上皮細胞一樣，具有天然免疫的功能，多年來未見研究報道。TLR9是特異識別包含未甲基化CpG基序的細菌DNA（CpGDNA）的天然免疫受體，在許多組

2、織細胞均可快速激活天然免疫反應(yīng)，并啟動后續(xù)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，在組織細胞免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，目前在抗感染、抗過敏和抗腫瘤治療中已取得了很大的研究進展。本課題組發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的成牙本質(zhì)細胞樣細胞表達TLR9，提示TLR9可能介導(dǎo)成牙本質(zhì)細胞的天然免疫功能。但是對于體內(nèi)的成牙本質(zhì)細胞是否表達TLR9、TLR9是否特異識別細菌DNA、TLR9活化后細胞內(nèi)信號途徑以及下游基因表達情況國內(nèi)外尚未見報道。
　　面對細菌入侵，除了免疫反應(yīng)

3、，形成第三期牙本質(zhì)是牙髓發(fā)揮防御和修復(fù)能力的另一種主要方式。許多研究證實DSPP基因表達產(chǎn)物在牙本質(zhì)形成和礦化，以及第三期牙本質(zhì)形成過程中均發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。由于在細菌感染導(dǎo)致成牙本質(zhì)細胞或成牙本質(zhì)細胞樣細胞形成第三期牙本質(zhì)的過程中伴隨DSPP基因表達，那么成牙本質(zhì)細胞內(nèi)TLR9信號途徑在被細菌DNA活化后是否調(diào)控DSPP基因表達國內(nèi)外尚未見研究報道。
　　綜上所述本實驗通過分子生物學(xué)實驗方法對TLR9、DSPP基因進行研究，旨

4、在闡明TLR9介導(dǎo)成牙本質(zhì)細胞天然免疫反應(yīng)和調(diào)控DSPP基因表達的細胞內(nèi)信號途徑。探討齲病進展過程中，細菌DNA感染、成牙本質(zhì)細胞免疫反應(yīng)、DSPP基因表達與第三期牙本質(zhì)形成相互之間的聯(lián)系，對闡明牙髓病病因、牙髓損傷修復(fù)的分子機制和DSPP基因表達調(diào)控規(guī)律有重要意義，為免疫防齲研究和活髓保存治療提供新的思路和途徑。
　　1TLR9、DSPP在成牙本質(zhì)細胞和牙髓組織中的表達
　　首先收集小鼠牙髓組織利用組織塊抽提RNA方法提取

5、總RNA，反轉(zhuǎn)錄，行PCR擴增觀察TLR9mRNA在牙髓組織中的表達；其次從小鼠OLC成牙本質(zhì)細胞系中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄，行PCR擴增觀察TLR9mRNA、DSPPmRNA的表達。1％瓊脂糖凝膠電泳顯TLR9mRNA在小鼠牙髓組織中和OLC細胞系中均有顯著表達，DSPPmRNA在OLC細胞系中有顯著表達。TLR9mRNA分子量198bp，DSPPmRNA分子量151bp。
　　2CpGDNA對OLC細胞內(nèi)TLR9、DSPP基因表

6、達調(diào)控
　　6孔板培養(yǎng)OLC細胞，用CpGODN-A和CpGODN-B刺激細胞，設(shè)置時間梯度為0、3、6、9、12、24小時。提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄，行PCR擴增和實時定量PCR以觀察TLR9mRNA、DSPPmRNA的表達量變化。1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果和實時定量PCR結(jié)果顯示CpGODN-A刺激組中TLR9mRNA、DSPPmRNA表達量無明顯變化。CpGODN-B刺激組中TLR9mRNA、DSPPmRNA表達量呈現(xiàn)先升高后降低的

7、變化，6小時表達量最高，且6小時組是0小時組的3倍。
　　3參與CpGOND調(diào)控DSPP基因的表達的細胞內(nèi)信號途徑
　　三種細胞信號途徑抑制劑：ERK信號途徑抑制劑，PD98059；p38信號途徑抑制劑，SB203580；NF-κB信號途徑抑制劑，PDTC。OLC細胞經(jīng)以上三種抑制劑（濃度為30μmol/L）作用后，加入CpGODN-B刺激6小時后提取總RNA，實時定量PCR結(jié)果顯示ERK和NF-κB組DSPPmRNA表達明