鱖caveolin-1基因的克隆及其功能研究.pdf

1、胞膜窖(Caveolae)是一種富含膽固醇、鞘糖脂和鞘磷脂等物質(zhì)的結(jié)構(gòu)性細(xì)胞器，普遍存在于哺乳動(dòng)物中細(xì)胞膜上。窖蛋白(Caveolin-1)是胞膜窖的主要組成蛋白，隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)其參與了許多細(xì)胞生命活動(dòng)，例如細(xì)胞內(nèi)吞(endocytosis)、膽固醇運(yùn)輸、細(xì)胞膜組裝、信號(hào)傳導(dǎo)和腫瘤生成等。
　　 本文通過(guò)簡(jiǎn)并PCR、RACE等技術(shù)獲得鱖魚(yú)(Siniperca chuatsi)中的caveolin-1(mCav-1

2、)的全長(zhǎng)cDNA序列。mCav-1蛋白與哺乳動(dòng)物中的caveolin-1蛋白有著相似的蛋白結(jié)構(gòu)域：caveolin的標(biāo)志性肽段(FEDVIAEP)、腳手架區(qū)(CSD)、C端保守蛋白結(jié)構(gòu)域。然而，在mCav-1上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)第14位的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，而此磷酸化位點(diǎn)對(duì)于大部分物種的caveolin-1功能的發(fā)揮起著至關(guān)重要的作用。通過(guò)構(gòu)建mCav-1的原核和真核表達(dá)載體進(jìn)而制備mCav-1的多克隆抗體，免疫印跡結(jié)果顯示mCav-1蛋白的α和β

3、亞型均有表達(dá)，且其在鱖各個(gè)組織的表達(dá)情況與目前報(bào)道的其他脊椎動(dòng)物基本一致。然而令人感興趣的是鱖脾臟中mCav-1表達(dá)量最高，與一般認(rèn)為脾臟中胞膜窖含量少的結(jié)論不一致。通過(guò)免疫熒光及免疫印跡方法對(duì)mCav-1蛋白進(jìn)行細(xì)胞定位，證明其的確是分布于細(xì)胞膜上的胞膜窖上，但細(xì)胞通過(guò)MβCD、filipinⅢ或naystatin等能結(jié)合膽固醇或去除膽固醇的藥物處理后，mCav-1蛋白的定位會(huì)發(fā)生變化。通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，鱖魚(yú)細(xì)胞中mCav-1蛋白的

4、表達(dá)量隨著傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)感染時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)，F(xiàn)ar-Western結(jié)果表明ISKNV上可能存在著跟mCav-1特異性相結(jié)合的蛋白。Cavelin-1的腳手架區(qū)是其與其它信號(hào)分子相互作用位點(diǎn)，本研究設(shè)計(jì)并人工合成了能特異性結(jié)合mCav-1腳手架區(qū)結(jié)合的多肽，定量PCR等實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其不但能抑制細(xì)胞脂類(lèi)的運(yùn)輸，而且可以抑制poly(I∶C)誘導(dǎo)的Jak-Stat信號(hào)通路。本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了mCav-1蛋白定位于胞膜窖