天然免疫分子人TLR-2配基模肽及其特性的研究.pdf

1、本研究分為兩部分，分述如下： 第一部分：人TLR-2基因的克隆、表達(dá)與鑒定 1.人TLR-2胞外段(ED)蛋白的克隆與表達(dá)根據(jù)Genebank所提供的人TLR-2全基因序列，利用RT-PCR技術(shù)從人外周血單核細(xì)胞中克隆了人TLR-2基因，構(gòu)建了pcDNA3.1+/TLR-2ED重組質(zhì)粒，利用真核表達(dá)系統(tǒng)獲得了TLR-2ED重組蛋白，同時證明該重組蛋白可與商品抗TLR-2多抗及用pcDNA3.1+/TLR-2全長質(zhì)粒免疫的

2、小鼠血清反應(yīng). 2.人TLR-2全長基因克隆及真核表達(dá)以RT-PCR技術(shù)從人外周血單核細(xì)胞獲得TLR-2全基因后克隆至pcDNA3.1+，然后將鑒定正確的pcDNA3.1+/TLR-2全長質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，經(jīng)G418加壓篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)人TLR-2全長基因的CHO細(xì)胞。RT-PCR和免疫組化鑒定結(jié)果表明CHO/TLR2細(xì)胞中有TLR-2基因和蛋白表達(dá)。 3.抗人TLR-2胞外段不同片段的抗體制備以CHO/TLR-2細(xì)胞

3、和TLR-2a/His蛋白免疫家兔，制備針對TLR-2全長分子及其小片段的多克隆抗體。 4.人TLR-2胞外段蛋白的生物活性鑒定在獲得了胞外段及其小片段純化蛋白和相應(yīng)的抗體后，用兩種方法鑒定其與TLR-2天然配基肽聚糖(PGN)、磷壁酸(LTA)和脂多糖(LPS)的結(jié)合，結(jié)果顯示TLR-2ED、TLR-2a、TLR-2c均可結(jié)合三種配基，其中與PGN和LTA的結(jié)合更強(qiáng)，這完全符合TLR-2主要識別革蘭氏陽性菌產(chǎn)物的特性。令人意外

4、的是靠近細(xì)胞膜的TLR-2c居然可以結(jié)合三種配基，提示為構(gòu)像性識別。 第二部分：人TLR-2胞外段配基模擬肽的篩選和鑒定在上述工作的基礎(chǔ)上利用噬菌體肽庫技術(shù)，以真核表達(dá)的人TLR-2胞外段蛋白為釣餌從噬菌體線性12肽庫和環(huán)7肽庫中篩選能與TLR-2結(jié)合，并能夠模擬配基結(jié)構(gòu)的短肽序列。 1.以TLR-2胞外段蛋白為釣餌進(jìn)行噬菌體線性12肽庫篩選經(jīng)兩次獨(dú)立的篩選共獲33個陽性克隆，測序所得結(jié)果均為同一序列：G-G-S-G-T

5、-S-R-T-P-I-L-G(命名為P12-1)，蛋白序列分析結(jié)果顯示P12-1富含小分子疏水氨基酸，其水溶液呈弱酸性。通過配基抑制試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS和PGN都可明顯抑制TLR-2胞外段蛋白與陽性噬菌體克隆的結(jié)合。 2.以TLR-2胞外段蛋白為釣餌進(jìn)行噬菌體環(huán)7肽庫篩選為了獲得高活性的噬菌體模擬肽，又以TLR-2胞外段蛋白為靶進(jìn)行了噬菌體環(huán)7肽庫篩選，共獲得了12個陽性序列，經(jīng)過DNA序列測定發(fā)現(xiàn)其中9個陽性克隆的DNA序列同樣也

6、是完全一致，推導(dǎo)的氨基酸序列為：C-K-K-S-G-K-P-L-C。這一結(jié)果與線性12肽庫的篩選結(jié)果驚人地類似，提示在TLR2胞外段可能存在一高度保守的配基結(jié)合結(jié)構(gòu)域。 本研究克隆了人TLR-2全長、胞外段及三個小片段TLR-2a、TLR-2b、TLR-2c的基因，獲得了真核表達(dá)的TLR-2胞外段重組蛋白、原核表達(dá)的TLR-2a、TLR-2c，并制備了相應(yīng)的多克隆抗體，為后續(xù)研究做了充分的材料準(zhǔn)備；用真核表達(dá)胞外段重組蛋白為釣餌