LAPF和CD11b負(fù)向調(diào)控天然免疫應(yīng)答及其機(jī)制研究.pdf

1、天然免疫應(yīng)答是機(jī)體抵抗病原微生物入侵的第一道防線，但是，過(guò)度活化的天然免疫反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致組織器官的損傷，可導(dǎo)致自身免疫病的產(chǎn)生甚至造成病人死亡，所以，天然免疫應(yīng)答反應(yīng)需要及時(shí)活化以有效清除入侵的病原體，同時(shí)，其應(yīng)答程度與持續(xù)時(shí)間也應(yīng)控制在適度范圍內(nèi)以維持機(jī)體平衡，可見(jiàn)，天然免疫應(yīng)答反應(yīng)的負(fù)向調(diào)控對(duì)于機(jī)體維持免疫自穩(wěn)至關(guān)重要。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)與研究能夠負(fù)向調(diào)控天然免疫的細(xì)胞和分子逐步成為天然免疫研究領(lǐng)域的前沿?zé)狳c(diǎn)。本課題圍繞著兩個(gè)負(fù)向調(diào)控分子的作

2、用與相關(guān)機(jī)制，分兩部分開(kāi)展了負(fù)向調(diào)控天然免疫應(yīng)答及其機(jī)制研究，包括“LAPF抑制TLR觸發(fā)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α及其機(jī)制研究”和“CD11 b-Src信號(hào)通路促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生及其機(jī)制研究”，以期通過(guò)我們的研究，加深對(duì)天然免疫調(diào)節(jié)和免疫自穩(wěn)的認(rèn)識(shí)和理解。
　　第一部分 LAPF抑制TLR觸發(fā)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α及其機(jī)制研究
　　包含PH和FYVE結(jié)構(gòu)域的溶酶體相關(guān)凋亡誘導(dǎo)蛋白LAPF（又叫PLEKHF1）是我們實(shí)驗(yàn)室從

3、人樹(shù)突狀細(xì)胞cDNA文庫(kù)中通過(guò)隨機(jī)大規(guī)模測(cè)序發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的溶酶體相關(guān)蛋白并于2005年報(bào)道其參與TNF-α誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡。然而有關(guān)LAPF在天然免疫中的功能還沒(méi)有研究。在本課題中，我們制備了LAPF條件缺失的小鼠（lapfloxp/loxplyz2Cre+），發(fā)現(xiàn)LAPF條件缺失小鼠相比于雜合子對(duì)照小鼠在內(nèi)毒素休克模型中炎性細(xì)胞因子分泌增加，其中TNF-α顯著升高，同時(shí)肺臟和脾臟中TNF-α的mRNA水平也顯著升高，提示LAPF可能

4、負(fù)向調(diào)控天然免疫反應(yīng)與炎癥發(fā)生。
　　通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)LAPF缺失的巨噬細(xì)胞在TLR配體刺激下分泌TNF-α升高并且TAK-1、IKKα/β和p65的磷酸化活化水平顯著提高，表明LAPF能夠抑制NF-κB信號(hào)通路的活化。利用IP-質(zhì)譜分析結(jié)合體外IP驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)LAPF可以與TLR信號(hào)關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TIRAP和MyD88結(jié)合，為進(jìn)一步研究LAPF如何調(diào)控NF-κB信號(hào)通路、影響炎性細(xì)胞因子釋放奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分

5、 CD11b-Src信號(hào)通路促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生及其機(jī)制研究
　　整合素信號(hào)對(duì)于天然免疫應(yīng)答的調(diào)控一直是天然免疫的前沿?zé)狳c(diǎn)問(wèn)題。整合素對(duì)于天然免疫細(xì)胞的分化、發(fā)育、遷移、粘附和活化均有十分重要的作用。CD11b是整合素Mac-1的α鏈，CD11b的抗體常常用來(lái)篩選出巨噬細(xì)胞或者其它髓系來(lái)源的單核吞噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞根據(jù)表型和行使功能的不同又可以分為M1型（經(jīng)典性活化的）巨噬細(xì)胞和M2型（替代性活化的）巨噬細(xì)胞，分別釋放出促炎性細(xì)胞

6、因子和抑炎性細(xì)胞因子，M1和M2型巨噬細(xì)胞的平衡對(duì)于天然免疫的調(diào)節(jié)和自穩(wěn)至關(guān)重要。我們實(shí)驗(yàn)室以往發(fā)現(xiàn)CD11b能夠通過(guò)Src-Syk泛素化降解MyD88和TRIF，從而抑制天然免疫過(guò)程中TNF-α的產(chǎn)生。但是，CD11b-Src在巨噬細(xì)胞M1和M2的表型和功能中的作用并不清楚，值得進(jìn)一步研究。
　　我們發(fā)現(xiàn)在體外誘導(dǎo)腸炎模型中，CD11b缺陷的小鼠以及利用Src抑制劑Dasatinib腹腔注射處理的小鼠，結(jié)腸部位的炎癥反應(yīng)均更為嚴(yán)

7、重，小鼠TNF-α產(chǎn)量增加但I(xiàn)L-10的產(chǎn)量減少，同時(shí)，iNOS的表達(dá)增強(qiáng)但Arg-1的表達(dá)減弱。TNF-α和iNOS是M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志性分子，IL-10和Arg1是M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志性分子，這個(gè)現(xiàn)象提示了CD11b-Src信號(hào)可能促使巨噬細(xì)胞趨向于M2型巨噬細(xì)胞。為此，我們直接檢測(cè)了用Dasatinib處理并且誘導(dǎo)腸炎的小鼠結(jié)腸部位的巨噬細(xì)胞類(lèi)型，發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細(xì)胞比例增加、M2型巨噬細(xì)胞比例減少。隨后我們開(kāi)展了CD11b-Sr

8、c使巨噬細(xì)胞更趨向于M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)1）骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞中CD11b-Src可以抑制IFN-γ誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子iNOS的表達(dá)，CD11b-Src還能夠促進(jìn)IL-4誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子Arg-1和YM-1的表達(dá);2)CD11b通過(guò)促進(jìn)Src-Akt信號(hào)通路活化，促進(jìn)了TLR誘導(dǎo)的STAT6活化和IL-10釋放。
　　進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，Src能夠增強(qiáng)IL-4信號(hào)通路的Akt和STAT6活化，這

9、兩者均被報(bào)道能夠促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞表型分子的表達(dá)。但是，只有過(guò)表達(dá)STAT6能夠逆轉(zhuǎn)Src抑制劑對(duì)Arg1的下調(diào)作用，提示STAT6在此過(guò)程的重要作用。Src能夠和STAT6相互作用，形成復(fù)合體，也進(jìn)一步提示Src能夠參與活化STAT6。在TLR信號(hào)刺激下，Src則通過(guò)促進(jìn)PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85的泛素化降解，促進(jìn)PI3K-Akt信號(hào)通路活化，進(jìn)而通過(guò)負(fù)向調(diào)控GSK促進(jìn)AP-1的活化入核，最終促進(jìn)IL-10的產(chǎn)生。
　　綜上，CD