模式識別受體觸發(fā)的巨噬細胞天然免疫應(yīng)答調(diào)控的新機制研究.pdf

1、第一部分 microRNA-92a通過靶向MKK4負向調(diào)節(jié)TLR誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥反應(yīng)
　　天然免疫是機體防御病原體入侵的第一道有效防線，病毒、細菌等致病性病原微生物一旦入侵機體，將迅速啟動機體的天然免疫應(yīng)答，觸發(fā)炎癥反應(yīng)。在天然免疫細胞如巨噬細胞，樹突狀細胞等對病原微生物的識別過程中，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)作為一種模式識別受體發(fā)揮著重要作用。TLRs特異性識別病原體中特定的分子結(jié)構(gòu)，激

2、活其下游的MyD88或TRIF依賴的信號通路，激活MAPK、NF-κB或者IRF3信號，最終激活天然免疫細胞產(chǎn)生炎癥細胞因子和Ⅰ型干擾素，構(gòu)成機體免疫系統(tǒng)抵御病原體入侵的第一道屏障。MicroRNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類高度保守的長度約為21～23個bp的非編碼寡聚核苷酸，其功能主要是通過與mRNA的3'非編碼區(qū)(3'UTR)特異靶位點相互作用從而負向調(diào)控mRNA的翻譯。miRNA參與調(diào)控了多種生物學(xué)過程，如生長、發(fā)育、分化、

3、腫瘤的發(fā)生等。同樣，miRNA對免疫應(yīng)答和免疫細胞的分化和功能也起著十分重要的調(diào)控作用。已有多篇關(guān)于miRNA參與調(diào)控天然免疫應(yīng)答的相關(guān)報道，如miRNA-146、miRNA-101分別在炎癥反應(yīng)中起著負向和正向的調(diào)控作用。
　　miRNA-92a已被報道在腫瘤和血管生成方面起著重要作用，但其在天然免疫中的作用和意義未見報道。我們發(fā)現(xiàn)用多種TLR配體，如TLR2、TLR3、TLR4的配體LPS，PGN，PolyI∶C分別刺激小鼠原

4、代腹腔巨噬細胞后， miR-92a的表達水平在短時間內(nèi)下降。我們進一步檢測了miR-92a在MyD88或TRIF缺失的巨噬細胞中經(jīng)TLR配體刺激后的表達變化，發(fā)現(xiàn)miR-92a的表達下降同時由TLR信號途徑中的MyD88，TRIF通路所誘導(dǎo)。之后，我們將合成的siRNA轉(zhuǎn)染到巨噬細胞中，來模擬內(nèi)源性miR-92a的功能或特異性抑制其作用來進一步研究miR-92a的功能。研究發(fā)現(xiàn)miR-92a的過表達可明顯降低LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-

5、α和IL-6mRNA和蛋白表達水平，同時減低了JNK和C-JUN的磷酸化水平。相反地，抑制miR-92a功能后，巨噬細胞TNF-a和IL-6的表達增加，JNK/C-JUN信號通路增強。由于miRNA主要通過調(diào)控靶基因的表達進而發(fā)揮生物學(xué)功能，我們進一步通過miRNA靶點預(yù)測網(wǎng)站來尋找潛在的使miR-92a發(fā)揮上述功能的靶點分子。熒光素酶報告基因和蛋白檢測等實驗結(jié)果表明miR-92a可直接靶向抑制MKK4的表達，而MKK4是TLR信號中促

6、進JNK活化的關(guān)鍵中間信號分子。接著，我們進一步證實了MKK4的功能，干擾MKK4后，JNK/C-JUN信號通路減弱，繼而降低炎癥因子TNF-α和IL-6的表達和分泌。
　　綜上所述，miR-92a在巨噬細胞TLR配體誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中，可通過靶向抑制MKK4，從而降低JNK/C-JUN信號通路的活化，最終抑制炎癥因子的表達。該研究結(jié)果為巨噬細胞炎癥應(yīng)答的調(diào)控機制增添了新的認識，并可能為炎癥引起的免疫相關(guān)性疾病的診治提供新的靶標(biāo)。<

7、br>　　第二部分 microRNA-33通過靶向ABCA1和ABCG1促進TLR誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥反應(yīng)
　　TLRs(Toll-like receptors)是一類重要的病原分子模式PAMPs識別受體，在天然細胞如巨噬細胞，樹突狀細胞中廣泛表達。TLRs特異性識別病原體中特定的分子結(jié)構(gòu)，激活其下游的MyD88或TRIF依賴的信號通路，激活MAPK、NF-κB或者IRF3信號，最終激活天然免疫細胞產(chǎn)生炎癥細胞因子和Ⅰ型干擾素。mi

8、croRNAs(miRNAs)是一種進化上保守的長約21～23個核苷酸的非編碼RNA，其通過與靶基因的3'非翻譯區(qū)間結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因表達。miRNA在生物體內(nèi)發(fā)揮著重要的調(diào)控機制同樣，同樣對免疫應(yīng)答和免疫細胞的分化和功能也起著十分重要的調(diào)控作用。
　　由于在脂類代謝方面的關(guān)鍵作用，miR-33最近幾年受到了研究者的廣泛關(guān)注，但其在天然免疫中的作用和意義尚不清楚。我們發(fā)現(xiàn)用多種TLR配體，如TLR2、TLR3、TLR4的配

9、體HKLM，LPS，PolyI∶C分別刺激小鼠原代腹腔巨噬細胞后，miR-33的表達水平在刺激后期下降。我們進一步檢測了miR-33在MyD88或TRIF缺失的巨噬細胞中經(jīng)TLR配體刺激后的表達變化，發(fā)現(xiàn)miR-33的表達下降主要受到TLR信號途徑中的TRIF通路所調(diào)控。之后，我們將合成的siRNA轉(zhuǎn)染到巨噬細胞中，來模擬內(nèi)源性miR-33的功能或特異性抑制其作用來作進一步的研究。研究發(fā)現(xiàn)miR-33的過表達可明顯增加LPS誘導(dǎo)的炎癥因

10、子TNF-α和IL-6 mRNA和蛋白表達水平。相反地，抑制miR-33后，巨噬細胞TNF-α和IL-6的表達下降。膽固醇轉(zhuǎn)運蛋白ABCA1和ABCG1被報道是miR-33的直接靶點，且其在炎癥反應(yīng)中起著負向調(diào)控的作用。由此，我們猜測miR-33可通過靶基因ABCA1和ABCG1對炎癥起到調(diào)控作用。為此，我們首先驗證了在原代巨噬細胞中，miR-33可直接作用于ABCA1和ABCG1，使其mRNA和蛋白水平下降。ABCA1-/-，ABCG

11、1-/-小鼠來源的巨噬細胞中，過表達miR-33對炎癥因子的正向調(diào)控作用減弱。同時，巨噬細胞內(nèi)ABCA1和ABCG1的表達增加也減弱了miR-33對炎癥因子的正向調(diào)控作用。接著，我們進一步研究了miR-33調(diào)控TLR觸發(fā)的炎癥應(yīng)答的機制。ABCA1和ABCG1協(xié)同負責(zé)轉(zhuǎn)運細胞內(nèi)的膽固醇到細胞外，從而降低細胞膜內(nèi)游離膽固醇的含量，進而影響脂筏的含量，抑制TLR信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，我們檢測了miR-33對細胞膜脂筏含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-

12、33可增加細胞膜內(nèi)的脂筏含量，從而增強TLR信號，主要是NF-κB信號，最終促進炎癥因子TNF-a和IL-6的表達和分泌。脂筏結(jié)構(gòu)干擾化合物處理細胞后，miR-33對炎癥因子的調(diào)控作用減弱，進一步驗證了miR-33可通過調(diào)節(jié)細胞膜脂筏的含量來調(diào)控TLR觸發(fā)的炎癥應(yīng)答。另一方面，miR-33也可抑制抗炎因子IL-10的表達，協(xié)同促進炎癥因子的表達。
　　綜上所述，在巨噬細胞中，可能存在以下調(diào)控網(wǎng)絡(luò):LPS刺激后，TRIF信號通路可降

13、低miR-33的表達，miR-33的下降釋放了對靶基因ABCA1和ABCG1的抑制，從而促進細胞內(nèi)游離膽固醇的外流，膜內(nèi)脂筏含量降低，TLR信號減弱。另一方面，miR-33下降后，抗炎因子IL-10的表達增加，兩者協(xié)同抑制炎癥因子的表達。本課題的研究結(jié)果為巨噬細胞炎癥應(yīng)答的調(diào)控機制增添了新的認識，提示了膽固醇與炎癥之間存在的關(guān)系，為炎癥引起的免疫相關(guān)性疾病的診治提供新的思路。
　　第三部分IL-9對PAMPs誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥反應(yīng)

14、的調(diào)控作用以及機制研究
　　Interleukin9(IL-9)起初最為一種T細胞和肥大細胞的生長因子被研究者所認識。近十幾年的研究揭示了IL-9更多的生物學(xué)功能以及產(chǎn)生機制，引起了研究者的廣泛關(guān)注。初始CD4+T細胞在體外TGF-β和IL-4培養(yǎng)下能高分泌IL-9，分化成Th9細胞。
　　IL-9通過與IL-9受體結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)活性。IL-9能促進T細胞和肥大生長之外，對B細胞、固有淋巴細胞、單核細胞等的生長和功能也具有

15、調(diào)控作用。IL-9能夠促進LPS誘導(dǎo)激活的人巨噬細胞和單核細胞分泌TGF-β，并降低TNF-α的表達，從而抑制突發(fā)性氧化作用。IL-9也能抑制APC誘導(dǎo)的Th1型免疫應(yīng)答。
　　IL-9在各類疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著不同的作用。在超敏反應(yīng)和自身免疫性病中，IL-9作為一種炎癥分子，能加速疾病的發(fā)展;而在寄生蟲感染和皮膚移植中，IL-9能促進機體清除病原體以及移植物免疫耐受的形成。巨噬細胞作為炎癥應(yīng)答的主要細胞，在病原體感染和炎癥反應(yīng)

16、中起著關(guān)鍵的作用。病原菌都有一些保守的特征性分子，稱為病原菌相關(guān)分子模式PAMPs(pathogen-associated molecularpatterns)。細胞表面的模式識別受體PRRs通過識別病原菌的PAMPs而激發(fā)免疫反應(yīng)。一旦識別了病原體，PRRs就會激活其下游一系列的信號通路，活化天然免疫細胞產(chǎn)生炎性細胞因子和Ⅰ型干擾素等細胞因子，從而啟動天然免疫應(yīng)答。而目前，IL-9對PAMPs誘導(dǎo)的巨噬細胞炎癥應(yīng)答的調(diào)控作用尚未清楚。

17、因此，本研究的目的主要在于了解IL-9是否參與該過程，從而進一步了解IL-9在炎癥疾病中作用。
　　利用IL-9基因敲除小鼠，我們發(fā)現(xiàn)，IL-9-/-小鼠骨髓來源的巨噬細胞在各類PAMPs刺激下，炎癥因子TNF-α，IL-6，IL-1β的表達顯著下降。之后，我們單獨用IL-9處理原代巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)高濃度的IL-9能誘導(dǎo)原代巨噬細胞產(chǎn)生IL-6，TNF-α。同時，用低濃度的IL-9處理能夠增強原代巨噬細胞對PAMPs誘導(dǎo)的炎癥因子的