[免疫學(xué)]補體參與反應(yīng)-t細胞數(shù)量及其功能檢測

1、實驗三 補體參與的反應(yīng) T細胞數(shù)量及其功能檢測,,Part I 補體參與的反應(yīng) 補體的溶血反應(yīng) Part II T細胞數(shù)量及其功能檢測 E花環(huán)形成試驗－－數(shù)量測定 淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗： 形態(tài)學(xué)方法

2、 3H—TDR摻入法 MTT比色法,功能,Part I 補體參與的反應(yīng),復(fù)習,1.補體的溶血反應(yīng),原理 綿羊紅細胞（SRBC ）作為抗原與其相應(yīng)抗體（溶血素）結(jié)合后，通過經(jīng)典途徑激活補體，產(chǎn)生膜攻擊作用，最后導(dǎo)致紅細胞溶解，發(fā)生溶血反應(yīng)。 材料 1．抗原：2%綿羊紅細胞； 2．抗體(溶血素)； 3

3、．補體：健康豚鼠新鮮血清 4．生理鹽水、24孔板等。,步驟,1、取24孔板，按下表加入各成分； 2、將24孔板放在37℃溫箱內(nèi)15-30min，觀察并記錄結(jié)果。,結(jié)果:,Part II T細胞數(shù)量及其功能檢測,2.E花環(huán)形成試驗,原理人外周血T細胞表面具有天然的能與綿羊紅細胞(SRBC)表面糖肽相結(jié)合的受體－E受體（CD2分子），可結(jié)合SRBC形成花環(huán)樣細胞團，是T細胞特有的表面標志。,檢測T細胞數(shù)量，間接判斷機體的

4、細胞免疫狀況 。,材料肝素抗凝血、綿羊紅細胞(SRBC)淋巴細胞分層液、Hank’s液、1640培養(yǎng)液、0.5％戊二醛固定液、燦爛甲酚蘭染液試管、滴管、離心機、微量移液器、玻片、顯微鏡等,步驟： （動作輕柔；分清滴管及槍頭?。。。?⑴取肝素抗凝血與等量Hank’s液稀釋混勻血3ml，用滴管貼管壁（傾斜30°）輕輕疊加于3ml分離液上（界面要清晰）→→→ 配平后1800rpm離心13mins。,1.淋巴細

5、胞懸液的制備：,人淋巴細胞比重：1.070淋巴細胞分層液：1.077人紅細胞比重：1.092,⑵ 另取一支滴管，仔細吸出位于血漿和分離液之間的乳白色的單個核細胞，放入盛有5mlHank’s液的試管→→→2000rpm離心5mins?！?3)棄上清（傾倒時液體不要回流），將沉淀的淋巴細胞輕彈混勻后加入Hank’s液5ml，重復(fù)離心兩次。2.棄去上清，留經(jīng)過洗滌的淋巴細胞懸液（約0.1ml）與綿羊紅細胞0.1ml 、1640營養(yǎng)液0

6、.1ml混合（分清槍頭）→→→輕彈混勻后放于37℃溫箱15mins。,＊離心時要配平,3. 取出試管，500rpm離心5mins。（注意此步非常關(guān)鍵，轉(zhuǎn)速一定要慢，一啟動即關(guān)，來回數(shù)次即可）,室溫靜置2-3mins4. 吸去100-150ul上清液，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，沿管壁滴加1滴(50ul)戊二醛，輕輕混勻靜置5mins。5. 取一滴（25ul）液體滴片，加一滴燦爛甲酚蘭染液，加蓋玻片。,6.高倍鏡下觀察，計數(shù)100個淋巴細胞，計算花

7、環(huán)形成率。淋巴細胞上結(jié)合≥3個SRBC者為E花環(huán)陽性。,正常參考值：EtRFC：64.4±6.7％； EaRFC：23.6±3.5％； EsRFC：3.3±2.6％,結(jié)果,,,SRBC,淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗 －－,原理 T細胞在體外培養(yǎng)時，受到非特異性有絲分裂原(如PHA、ConA)或特異性抗原刺激后，可出現(xiàn)

8、代謝旺盛、蛋白質(zhì)和核酸合成增加、細胞體積增大并能進行分裂的淋巴母細胞，稱淋巴細胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的高低，可反映機體的細胞免疫水平，故可作為測定機體免疫功能的指標。三種方法形態(tài)學(xué)方法、 3H-TdR摻入法、 MTT比色法,根據(jù)胞核的大小、核與胞漿的比例、胞漿染色性、核的構(gòu)造與核仁的有無。成熟小淋巴細胞：核染色深、沒有核仁，胞漿少、染色為輕度嗜堿性；過渡型淋巴細胞：大于小淋巴細胞、核染色比較疏松，胞漿比較多，但是出現(xiàn)核仁；

9、淋巴母細胞：體積增大，形態(tài)不規(guī)則，核變大、核質(zhì)染色疏松，有核仁1－2個，胞漿豐富，常出現(xiàn)胞漿空泡；其他細胞：中性粒細胞在培養(yǎng)72消失后，絕大部分衰變或死亡呈碎片。,形態(tài)學(xué)方法：〔鏡下觀察〕 －－－淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗,淋巴細胞轉(zhuǎn)化率：,正常參考值：80％,紅細胞,未轉(zhuǎn)化淋巴細胞,轉(zhuǎn)化的淋巴細胞,淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗 瑞氏染色 10×40,,,,3H—TDR摻入法

10、 －－－淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗,T細胞受到PHA或特異性抗原刺激后，發(fā)生有絲分裂，細胞進入S期，此時在細胞培養(yǎng)液中加入氚標記的胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TDR)，可以被細胞攝入而摻入DNA中，通過β-液體閃爍計數(shù)器測定3H-TDR的摻入量，判斷細胞的增殖程度。,MTT比色法 －－－淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗,MTT為一種黃色可溶性物質(zhì)，細胞活化增殖時通過線粒體能量代謝，將MTT代謝成藍紫色的甲臢，沉積于細胞內(nèi)或細胞周圍，形